| 研究課題/領域番号 |
17K11828
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
KA 井上 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (90302877)
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| 研究分担者 |
渡部 徹郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00334235)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、上皮扁平口腔がんの浸潤・転移において上皮間葉移行（epithelial-mesenchymal transition; EMT）を誘導するエクソソームに着目し、EMTにおけるHSPGを介したエクソソームの取り込みについて明らかにするために以下の実験をおこなった。具体的には、種々の口腔扁平上皮がん細胞（HOC313、HOC313-LM、 SAS、HSC4細胞株など）を用いて、EMTを誘導し、EMTマーカーの発現に与える効果を検討した。EMTを誘導した細胞からエクソソームを精製し、そのエクソソームのキャラクタリゼーションを行なった。結果、エクソソームのマーカー分子としてCD63、TSG101、ALIXを検出することができた。また、HSPGの各細胞における発現及びエクソソームにおける局在を解析することができた。詳しい解析を行なったところ、EMTを誘導することで、SASやHSC4細胞由来のエクソソームに局在しているHSPGの種類が変化した。通常状態がん細胞において、EMTを誘導したがん細胞由来のエクソソームがどのように取り込まれるのかについても検討した。結果、EMTを誘導したがん細胞由来のエクソソームは、通常細胞由来のエクソソームより効率的に取り込まれた。また、このエクソソームの取り込みにより、通常状態の細胞の運動が促進された。一方、悪性度が異なる口腔扁平上皮がん細胞（HOC313及びHOC313-LM）を用いた実験系で、悪性化とTGF-βとEMTの関与について検討した。その結果、悪性度が高いHOC313-LM 細胞をTGF-β1処理したところ、細胞の運動能が亢進することを発見した。TGF-βシグナルとRHOシグナルは口腔がん悪性化の様々なステップにおいて多様な作用を果たすことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
口腔扁平上皮の上皮間葉移行を誘導するエクソソームを調整するうえで、適切な細胞株を選択するのに時間を要した。具体的には、当初、口腔扁平上皮がん細胞に常的活性化型TGF-β受容体遺伝子（ALK5-CA）を導入し、自動的にEMTを誘導させる予定であったが、AKL5-CAを発現させたところ、細胞の増殖に影響を与え、実験には不適であることが判明した。そこで、EMTの誘導の手法として、通常の細胞にTGF-βを添加する方法に切り替え、その至適な条件の検討を行なった。さらに、質量分析を用いてエクソソームのタンパク成分を解析するにあたって、試料調製の条件検討が必要であったため、遅れが発生した。現在、種々の口腔扁平上皮がん細胞に対してEMTを誘導し、試料の調整を行なっている。さらに、EMTを誘導した細胞由来のエクソソームを用いてエクソソームの取り込み実験の試験系を確立するために、蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデル（蛍光標識されたエクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光標識する）が必須となっているが、その細胞の作製にも遅れが発生した。現在、蛍光標識されたCD63-GFPおよびCD63-KusabiraOrangeタンパク質を発現している悪性度の高い口腔扁平上皮がん細胞株および悪性度の低い口腔扁平上皮がん細胞株を作製中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、昨年度できなかった以下の実験を行う。① 蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデルを樹立する。TGF-βによりEMTを誘導した時のエクソソーム分泌を観察する。さらに、②質量分析法 (LC/MS法) を用いて、エクソソームに特異的に局在するタンパク質を同定する。③CD63-GFPおよびCD63-Kusabira Orangeを発現している口腔扁平上皮がん細胞から蛍光標識されたエクソソームを精製し、そのエクソソームの取り込みを、蛍光顕微鏡を用いて評価する。また、悪性度の高い口腔がん細胞由来の蛍光標識エクソソームががん微小環境構成因子に与える作用を検討する。具体的には、内皮細胞や悪性度の低い口腔がん細胞株にエクソソームを添加し、EndMTやEMTの誘導を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
[次年度使用額が生じた理由]
実験の遅れが発生したため、昨年度の使用額が予定より少なくなり、代わりに次年度に使用する必要が生じた。
[使用計画]
実験の遅れにより昨年度実施することができなかった前項②の実験 (LC/MS法を用いたエクソソームに存在するタンパク質の同定) を行うため、質量分析用の試薬が必要。さらに、前項③ (共焦点顕微鏡を用いた観察) において、エクソソームの精製に必要な試薬、抗体、及び分子生物学的実験の試薬が必要。また、質量分析機器や共焦点顕微鏡が設置されている本学共同実験設備の分析機器使用料のために経費が必要である。さらに、今年度の日本生化学会学大会また日本癌学会大会に参加し情報収集する予定であり、旅費が必要。
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