| 研究課題/領域番号 |
17K11828
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
KA 井上 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (90302877)
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| 研究分担者 |
渡部 徹郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00334235)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
がんの進展の過程 (EMT、浸潤、移動)および抗がん剤耐性の獲得におけるエクソソームの役割が注目を集めているが、口腔扁平上皮がんのエクソソームの性質、取り込み、機能などについては不明な点が多く残っている。一方で、エクソソームの形成や取り込みには、ヘパラン硫酸プロテオグリカン (HSPG) が関与していることが報告されている。
本研究では口腔扁平上皮がんのEMTを誘導するエクソソームに着目し、EMTにおけるHSPGを介したエクソソームの取り込みやそのエクソソームの機能について明らかにすることを目的とした。蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデルとして、エクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光タンパク質として発現させた口腔扁平上皮がん細胞株を作製した。さらに、昨年度に確立されたエクソソームの精製法を用いて、TGF-βで処理した細胞から分泌されているエクソソームを精製し、EMTの誘導能を検討した。その結果、TGF-β処理した細胞から調製したエクソソームは口腔がん細胞の運動能を促進するとともにがん細胞の運動に重要な働きを持つEMTマーカーの発現上昇を引き起こした。すなわちエクソソームを取り込むことで、口腔がん細胞がEMTを実行する可能性が示唆された。TGF-β刺激により産生されたエクソソームと、TGF-β非依存的に産生されたエクソソームの機能を比較するために、CRISPR-Cas9のシステムを用いてTGF-βシグナルに必須な転写因子Slugを欠失させた口腔扁平上皮がん細胞株を作成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
EMTを誘導した細胞由来のエクソソームを用いて、エクソソームの取り込みを検出する実験系の確立に取り組んだ。蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデル（エクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光標識した細胞）を樹立するうえで、発現ベクターの作成及び細胞株樹立に時間がかかった。現在、蛍光標識されたエクソソームを用いて、がん微小環境構成因子に与える作用の検討を行なっている。さらに、TGF-βで処理した際に分泌されているエクソソームを用いたEMTの誘導実験にあたって安定な結果を得るために、至適な条件の検討に時間がかかった。エクソソームの取り込みにおいてHSPGの役割について検討するために、細胞表面のHSPGの発現を変化させた細胞モデルが必須となっている。これまでの報告ではエクソソームの取り込みにはHSPGのヘパラン硫酸鎖が重要な役割を持つことが示威されている。そこで、口腔がん細胞においてHSPGの糖鎖部位の生合成過程で重要な酵素、EXT1遺伝子をノックアウトした口腔扁平上皮がん細胞株の作製を行なっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、以下の実験を行う。①昨年度で樹立した蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデル（CD63-Kusabira Orangeを発現している口腔扁平上皮がん細胞）を用いて、エクソソームががん微小環境を構成する細胞（がん細胞及び内皮細胞）に対する作用及び微小環境構成因子の発現に対する作用を検討する。②HSPGの糖鎖部位の生合成過程で重要な酵素、EXT1遺伝子をノックアウトした口腔扁平上皮がん細胞株を樹立する。③蛍光標識されたエクソソームのEXT1欠損細胞株への取り込み実験を行なう。④Slug 遺伝子をノックアウトした口腔扁平上皮がんSAS細胞において、TGF-βで処理した際分泌されているエクソソームを用いて、それらのエクソソームのEMT誘導能を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【次年度使用額が生じた理由】
実験の遅れが発生したため、昨年度の使用額が予定より少なくなり、代わりに次年度に使用する必要が生じた。
【次年度使用計画】
実験の遅れにより昨年度実施することができなかった前項①（共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識されたエクソソームの取り込みの観察）において、エクソソームの精製に必要な試薬、及び抗体が必要となっている。それに伴い、共焦点顕微鏡が設置されている本学共同実験設備の分析機器使用料のための経費が必要である。さらに、ノックアウト細胞を樹立するために分子生物学的実験の試薬の購入予定である。2019年度も日本癌学会大会に参加し情報収集する予定であり、そのために旅費が必要である。さらに、2019年には2年に1度に開催されている国際プロテオグリカン学会が日本で開催される。その場で本研究の成果発表をする予定であり、旅費が必要である。
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