| 研究課題/領域番号 |
17K11953
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
大島 邦子 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (80213693)
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| 研究分担者 |
大島 勇人 新潟大学, 医歯学系, 教授 (70251824)
早崎 治明 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60238095)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 歯胚移植 / 幹細胞 / 歯根膜 / GFP / TetOP-H2B-GFP / BrdU |
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| 研究実績の概要 |
組織の修復・再生には組織幹細胞が大きな役割を担うことが知られているが、移植歯の生着の鍵を握る歯根膜幹細胞の動態については不明な点が多い。今回、マウスを用いた歯胚移植実験を行い、移植後のドナー・レシピエント相互作用における歯根膜幹細胞の動態を検証し、その維持・分化機構の解明を目的とした。
胎生期15～17日に母獣の腹腔内にBrdUを投与することにより(胎生期ラベリング法）、非対称分裂をする幹細胞／前駆細胞をラベルし（ラベル細胞）、深麻酔下で生後1～2日齢のラベルB6マウス下顎第一臼歯の歯胚を摘出後、歯根形成期の生後2週齢の非ラベルB6マウス上顎第一臼歯抜歯窩へと移植した。3日～3週間後にアルデヒド系固定液で灌流固定し、μCT解析、EDTA脱灰後、パラフィン切片を作製し、抗BrdU、抗Gli1、抗ペリオスチン抗体を用いた免疫染色を行い光顕で観察した。さらに、全ての細胞がGFPを発現するGFPトランスジェニックマウスをドナーまたはホストとした歯胚移植後の治癒過程を検索するとともに、TetOP-H2B-GFPマウス（E14.5にドキシサイクリン投与）における歯周組織発生過程も合わせてGFP免疫組織化学により検索した。
歯周組織発生過程において、胎生期ラベリング法では生後2週までに歯根膜ラベル細胞が消失するのに対し、TetOP-H2B-GFPマウスでは、歯根膜にラベル細胞が維持されており、Gli1発現と重なっていた。移植実験では、術後2週に萌出を完了し、歯根形成も正常に進行した。GFPマウスとB6マウス間の歯胚移植実験により、マラッセの上皮遺残を含むセメント質寄りの歯根膜細胞と接合上皮はドナー由来、歯槽骨寄りの歯根膜細胞がドナーとホスト双方に由来することが明らかになった。以上より、歯根膜幹細胞と思われるラベル細胞は胎生15～17日に増殖しない細胞群であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定した計画通りに進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
TetOP-H2B-GFPマウスを用いた歯胚移植実験
胎生14日にDoxを投与したTetOP-H2B-GFPマウスと野生型マウスをそれぞれドナーまたはレシピエントとして歯胚移植を行っている。今後、歯根膜の形成過程とドナー・レシピエント双方の歯根膜幹細胞の動態、幹細胞とShhの関係性などを経時的網羅的に検索するため、移植後２週、4週、16週で灌流固定を行い、GFP、歯根膜マーカー（ペリオスチン）、Gli1、Shh、Patched1（Shhの受容体）、細胞増殖活性マーカー（Ki67）に対する免疫組織化学を行う。さらに、アポトーシス染色（TUNEL法）、in situハイブリダイゼーション（ISH）法またはRT-PCR法にてGli1、Shh、Patch1、細胞増殖マーカー（CyclinD1）、アポトーシスマーカー（Caspase3）遺伝子発現を解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
B6およびGFPマウス、H2B-GFPマウスが自家繁殖により一部購入数を抑えることができたことなどから今年度の使用額が抑えられているが、次年度、学会発表および論文発表の必要があることから、次年度に合わせて使用予定である。
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