| 研究課題/領域番号 |
17K11994
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
小方 頼昌 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (90204065)
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| 研究分担者 |
中山 洋平 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (30434088)
高井 英樹 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (30453898)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | アメロチン / FDC-SP / ODAM / 接合上皮 / 炎症 / 歯周病 / 歯肉上皮細胞 |
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| 研究実績の概要 |
Follicular dendritic cell-secreted protein(FDC-SP)は、濾胞樹状細胞で発現する低分子の分泌タンパク質であるが、歯周組織では歯根膜および接合上皮で発現する。上皮細胞でのFDC-SPの遺伝子発現に対する炎症性サイトカインの影響を解析した。
Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞をTNF-αで刺激すると、FDC-SP mRNA量は12時間後に最大になり、24時間後に減少した。TNF-α刺激3および6時間後にFDC-SPタンパク質量の増加を認めたが、12時間以降に減少した。FDC-SPルシフェラーゼ(LUC)コンストラクト(-116~-948塩基対上流)をCa9-22細胞に導入し、TNF-αで刺激すると、ルシフェラーゼ活性が上昇し、転写開始点から-345塩基対上流までに存在するYY1、C/EBP2およびC/EBP3配列にミューテイションを導入した-345mYY1、-345mC/EBP2および-345mC/EBP3ミューテイションコンストラクトを作成した。-345mYY1では、TNF-α刺激後の転写活性の上昇が抑制された。TNF-α刺激後のFDC-SPの転写活性の上昇は、protein kinase A (PKA)阻害剤、チロシンリン酸化阻害剤、MEK1/2阻害剤およびphosphoinositide-3-kinase（PI3)キナーゼ阻害剤によって抑制された。
Ca9-22細胞をTNF-αで刺激すると、アメロチン(AMTN)mRNAおよびタンパク質量は刺激6時間以降に増加した。-211、-353および-501AMTN LUCコンストラクトをCa9-22細胞に導入し、TNF-αで12時間刺激すると、LUC活性の上昇が認められ、-353AMTN LUCの C/EBP1、C/EBP2、YY1配列に変異を挿入すると、LUC活性の上昇が部分的に抑制され、C/EBP1とC/EBP2の両方に変異を導入するとさらに活性の上昇が抑制された。TNF-αおよびIL-1βによる-353AMTN LUC活性の上昇は、PKA阻害剤、チロシンリン酸化阻害剤、MEK1/2およびPI3阻害剤存在下で抑制された。以上の結果から、上皮細胞でのヒトFDC-SPとAMTN遺伝子発現は、TNF-α刺激後に、上記のシグナル伝達経路を介して調整されると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
歯根膜および接合上皮で発現するFDC-SPの遺伝子発現に対するTNF-α炎症性サイトカインの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でFDC-SP mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、FDC-SPルシフェラーゼ(LUC)コンストラクト(-116~-948塩基対上流)を作成し、Ca9-22細胞に導入してTNF-αで刺激した結果、ルシフェラーゼ活性が上昇し、同プロモーターの-345塩基対上流までに存在するYY1、C/EBP2およびC/EBP3配列にミューテイションを導入したミューテイションコンストラクトを使用したLUCアッセイの結果、TNF-α刺激後の転写活性の上昇が抑制されたことから、FDC-SP遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと。さらに、接合上皮で発現するヒトアメロチン(AMTN)に対するTNF-αの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でAMTN mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、同プロモーターの-353塩基対上流までの C/EBP1、C/EBP2、YY1配列に変異を挿入すると、LUC活性の上昇が抑制されたため、AMTN遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと、さらにシグナル伝達経路が判明したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
TNF-α刺激で、FDC-SPおよびAMTNの遺伝子およびタンパク質発現が増加することが明らかになった。ルシフェラーゼアッセイおよびミューテイションルシフェラーゼアッセイの結果から、遺伝子プロモーターのどの部分がTNF-α刺激に応答しているかがほぼ明らかになり、各種リン酸化阻害剤を使用したルシフェラーゼアッセイの結果、細胞内情報伝達系が明らかになった。今後、転写因子応答配列のオリゴヌクレオチドを合成し、ゲルシフトアッセイを行う。また、抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行う予定である。
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