| 研究課題/領域番号 |
17K12000
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
菱川 敏光 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (10421249)
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| 研究分担者 |
鳥海 拓 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (40610308)
本田 雅規 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70361623)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 歯周組織再生 / 細胞移植 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、歯周組織の治癒後の安定に重要と考えられるエナメル質とセメント質表層の上皮性および結合組織性付着の再生が有利に誘導できる因子を明らかにすることである。本年度は、in vivoでの担体を用いた移植実験による動物実験モデルの検証および細胞移植効果の確認および関連する因子の探索が主な研究の目的である。具体的には、初年度に採取した歯肉線維芽細胞の歯周組織欠損モデルへの移植実験を行なった。細胞の足場として初年度にコラーゲンゲルを選択したが、細胞移植を伴う繰り返し実験において細胞播種および播種後の移植操作における再現性を得ることが困難であったため、昨年度の計画に従いin vitroでの培養実験を行った新しいコラーゲンスポンジを足場として用いる変更を行なった。動物実験として、10週齢SDラットの上顎第一臼歯近心の歯肉欠損モデルに対する、４群（歯肉欠損のみ、歯肉欠損＋担体移植、歯肉欠損＋歯肉由来線維芽細胞播種担体移植、歯肉欠損＋歯肉由来線維芽細胞移植（注入））の移植実験および対照実験を行い、凍結切片による組織学的解析により治癒過程の差異について検討を行った。また、ラットの歯根膜および歯髄からの線維芽細胞の分離・培養については採取法の改善に加えて培養条件の検討を継続して行った。平成31年度は、歯肉由来細胞により検討を行ったタイムコースを用いて、凍結保存した3種類の細胞を移植することで、歯肉の再生および創傷治癒過程を観察し、術後初期の歯肉の機能回復の程度を比較する。特に歯面への上皮性付着および結合組織性付着の形成速度、その過程および関連する因子、形成される付着の性質を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度に計画したラット歯周組織由来細胞移植治療モデルの組織学的解析について、10週齢SDラットの上顎第一臼歯近心より口蓋側根分岐部にかけて辺縁歯肉を切除し露出歯根面のセメント質を除去する歯肉切除モデルにおいて歯肉の削除量等の検討を完了した。この動物実験モデルを用い、以下の４群の実験を行なった。各群は、歯肉欠損のみ、歯肉欠損＋担体移植、歯肉欠損＋線維芽細胞＋担体移植、歯肉欠損＋線維芽細胞移植とし、それぞれ術後７日および14日の新鮮凍結包埋試料およびその薄切切片を得た。この組織学的観察によって、歯肉切除およびセメント質削除を確認し、また、歯肉欠損後の治癒過程を経時的に確認し、術後7日において歯肉上皮の密着による切除創の閉鎖を認め、術後14日において上皮性付着の形成を確認できた。14日後の状態では、担体の有無および細胞移植の有無により、形成される上皮性付着の長さに変化が認められた。結合組織性付着の評価、セメント質の再生に関する評価については、現在分析中である。
本年度予定したマイクロアレイ・qPCRによる結合組織性付着に効果的な因子の検索については、具体的な分析方法の再検討のため、歯肉由来細胞を使用した治癒経過実験の完了後に行うこととした。このため、歯根膜由来細胞、歯髄由来細胞を含む移植を行う細胞群が間葉系幹細胞を含むかどうかの確認のための、フローサイトメーターと遺伝子発現解析による分析も併せて順延した。in vivoおよびin vitroの解析に必要な細胞数を得るために細胞の取得および培養を継続して行う。以上より、実験内容は概ね計画に従って遂行出来ているが、当初予定した実験の一部に変更および遅延が生じていることから、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成３１年度は、歯肉欠損モデルに対する細胞移植後の治癒について、組織学的解析による歯周組織再生、特に結合組織再生・セメント質再生の評価および、マイクロアレイ・qPCRによる結合組織性付着に効果的な因子の検索を行う。また、治癒過程について組織学的解析を行い、歯肉およびセメント質の再生程度、結合組織性付着の状態としてコラーゲン線維の走向と上皮性付着を観察し、正常組織と比較する。また、歯根膜由来細胞を用いた移植実験を行い、歯肉由来細胞との治癒経過の比較を行う。上記計画を実行するために、ラット歯根膜由来細胞の採取および培養を継続し、細胞移植実験および細胞形質の分析のための細胞数の確保を行う。
移植する細胞の種類によって歯周組織再生に有意な差があった時の組織（各群5頭）を採取し、これらの組織から抽出したＲＮＡやタンパクの網羅的発現解析を行い比較することで、結合組織付着特異的な因子を検索する。また、発現に差が認められた遺伝子に関して、その発現量をqPCRを用いて定量的に分析して結合組織性付着及び上皮性付着に効果的な遺伝子を同定する。
移植実験のプロトコールの単純化と実験環境の整備により、歯肉組織欠損モデルの施術時間を短縮できていることから、実験群の頭数を増やし実験期間の短縮を行う。網羅的発現解析による結合組織付着特異的な因子の検索では、次世代シークエンサーなどの新しい技術導入の可能性を検討し、解析方法を見直す事で実験期間の短縮を図る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年度、平成30年度の計画中、順延した移植細胞の表面抗原解析、多分化能解析にかかる費用が未使用となっており、今後同実験に使用する予定である。
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