2019 年度実施状況報告書

結合組織性付着に有効な因子を使った新規歯周組織治療法開発の基盤研究

研究課題

研究課題/領域番号	17K12000
研究機関	愛知学院大学
研究代表者	菱川敏光愛知学院大学, 歯学部, 講師 (10421249)
研究分担者	鳥海拓愛知学院大学, 歯学部, 講師 (40610308) 本田雅規愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70361623)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2021-03-31
キーワード	歯学 / 再生医学 / 細胞移植
研究実績の概要	細胞移植実験に用いる歯肉由来線維芽細胞および歯根膜由来線維芽細胞の採取・保存を行なった。歯肉由来細胞は十分な細胞数を繰り返し採取することができたものの、歯根膜由来細胞については再現性が低いために、採取法の検討を繰り返し行い、採取法を改善することで採取率および細胞数を向上させることができた。具体的には、培地中の抗菌薬の変更、組織分散に用いる酵素剤の変更、実体顕微鏡の導入、初代培養時の培地量の変更、を行なった。抜歯直後の第一臼歯および第二臼歯の歯根より歯根膜採取を行うため、口腔内細菌によるコンタミネーションが繰り返し起こっていたが、抗菌薬の変更によって細菌の繁殖は認められなくなった。また、酵素処理後の組織の洗浄時に起こる細胞のロスを減じるために、洗浄の必要のない酵素剤に変更したことも効果的であったと考えられる。また、初代培養時の培地量を減らすために培地残量の監視を強化できるよう、培養環境の変更を行なった。しかし、依然として採取ごとに採取率に大きな変動があることが課題である。採取した歯根膜線維芽細胞の一部はP2、P3およびP4で凍結保存を行い、一部で繰り返し継代培養を行なった。増殖速度は歯肉線維芽細胞と比較して緩慢に感じられたことから、細胞増殖活性の比較実験を行うことが課題となった。移植担体への細胞播種について、歯根膜由来細胞とコラーゲンスポンジを用いて検討を行なった。歯根膜由来細胞ではコラーゲンスポンジの表面に細胞接着しない場合があった。移植実験に際しては細胞の定着を十分確認した上で移植を行う必要があると考えられた。来年度に予定する移植実験では、細胞を播種した移植担体の数を多く準備し、細胞の定着を認めたものを実験に用いることで対応する計画を行なった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由研究計画において重要な歯根膜由来線維芽細胞の採取は成功したが、細胞数の確保および再現性の確認に時間を要した。実験計画の根幹となる細胞種であることから、採取手技の見直しを繰り返し行い、実験に必要な細胞数を確保するために細胞培養および凍結保存を行なった。既に採取が完了している歯肉由来線維芽細胞に比較して歯根膜由来線維芽細胞は、増殖速度が遅く培養日数が長期に及んだこと、および、移植担体への定着が困難であった。このため、結合組織生付着の獲得に関連する因子を検索するための、歯肉由来線維芽細胞との比較実験に至ることができず、遅れていると判断した。
今後の研究の推進方策	令和２年度は、準備した歯肉由来線維芽細胞および歯根膜由来線維芽細胞を歯肉欠損モデルに対して移植を行い細胞移植後の治癒を確認する。組織学的解析による歯周組織再生、特に結合組織再生・セメント質再生の評価および、マイクロアレイによる結合組織性付着に効果的な因子の検索を行う。また、治癒過程について組織学的解析を行うための資料採取を行う。上記計画を実行するために、ラット歯根膜由来細胞の採取および培養を継続し、細胞移植実験および細胞形質の分析のための細胞数の確保を行う。移植する細胞の種類によって歯周組織再生に有意な差があった時の組織(各群5頭)を採取し、これらの組織から抽出したRNAやタンパクの網羅的発現解析を行い比較することで、結合組織付着特異的な因子を検索する。移植実験の環境整備により、歯肉組織欠損モデルの施術時間を短縮できていることから、実験群の頭数を増やし実験期間の短縮を行う。網羅的発現解析による結合組織付着特異的な因子の検索では、次世代シークエンサーなどの新しい技術導入の可能性を検討し、解析方法を見直す事で実験期間の短縮を図る。また、発現に差が認められた遺伝子に関するqPCRを用いた分析は研究期間内には到達困難であると考えられることから、実験計画から除外し将来の研究計画とする。これにより、網羅的解析によって研究目的とした結合組織生付着に有効な因子の定量は不可能となるが、因子の探索という目的は達成できるものと考えられる。
次年度使用額が生じた理由	平成29年度、平成30年度、平成31年度の計画中、順延した移植細胞の表面抗原解析、多分化能解析にかかる費用が未使用となっており、今後同実験に使用する予定である。