| 研究課題/領域番号 |
17K12824
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
鈴木 哲矢 広島大学, 医歯薬保健学研究科(薬), 助教 (20573950)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | DNA損傷 / 変異 / 損傷乗り越え合成 / DNAポリメラーゼζ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、損傷乗り越えDNA合成 (Translesion DNA synthesis ; TLS) を行うDNAポリメラーゼ (Pol) の１つであるPolζが損傷を乗り越えた後も数十塩基のDNA合成を行い、損傷部位以外にも誘発する変異の生成と抑制の分子機構を明らかにすることを目的としている。はじめに、損傷塩基に対する部位がリーディング鎖あるいはラギング鎖として合成される2種類のシャトルプラスミドを構築し、さらに、変異スペクトルを正確に解析するために、各プラスミドにランダム配列を導入した。これらのプラスミドを用いて部位特異的に損傷塩基であるグアニンのベンゾピレン付加体 (BPDE-dG) を含むプラスミドを構築し、正確性が低いPolζを発現する細胞に導入し、損傷塩基がリーディング鎖あるいはラギング鎖にある時に誘発される変異頻度に違いがあるかを調べた。また、ミスマッチ修復が正常な細胞と欠損している細胞を用いて、PolζによるDNA合成によって形成したミスマッチがミスマッチ修復によって抑制されるのかを調べた。その結果、BPDE-dGによって誘発される変異頻度は、リーディング鎖およびラギング鎖で大きな違いは見られなかった。また、ミスマッチ修復の有無によっても大きな差は見られなかった。また、ノックイン細胞を作製するために、piggyBacトランスポゾンを利用したシームレスに塩基置換をゲノムに導入するためのターゲティングベクターを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
リーディング鎖とラギング鎖での誘発される変異頻度の違い、ミスマッチ修復の影響についての検討をある程度達成できた。変異スペクトルの解析までは達成できなかったものの、シャトルプラスミドにランダム配列を導入し、配列解析を効率的に出来るようにしたことやpiggyBacトランスポゾンを利用したシームレスに塩基置換をゲノムに導入するためのシステムを構築できたことから概ね順調に進捗していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
変異スペクトルを解析することで、リーディング鎖とラギング鎖の違いおよびミスマッチ修復の有無の影響について詳細に調べるとともに、複製型DNA PolであるPolεおよびPolδのエキソヌクレアーゼドメインに位置するアミノ酸に変異を導入し、エキソヌクレアーゼ活性を不活性化したPolεあるいはPolδを発現する細胞を構築し、複製型DNA Polの校正機能の影響について解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
変異スペクトル解析が十分に行えなった分、次年度使用額が生じてしまった。シーケンス解析に必要な消耗品の購入に使用する予定である。
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