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2018 年度 実施状況報告書

L-DNA/SNA回路の設計と細胞内RNAの高感度・高正確検出

研究課題

研究課題/領域番号 17K14514
研究機関名古屋大学

研究代表者

村山 恵司  名古屋大学, 工学研究科, 助教 (70779595)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワードDNA / L-DNA / 直交性 / 増幅回路 / RNA検出
研究実績の概要

本研究では、天然には存在しないL体のDNA (L-DNA)を用いることで、天然のD-DNAやD-RNAと非特異な反応を起こさないL-DNA回路を構築することを目的とする。すなわち、人工核酸SNAを媒介として、天然のD-RNA配列情報をL-DNAシグナル増幅回路に伝達させることで、細胞内RNAの高感度・高正確な検出を目指す。
本年度は、標的RNAに応答してL-DNAのInputシグナルを放出するSNAインターフェイスの再設計・最適化を行った。昨年度まではL-DNAとSNAを別々の鎖で設計していたため結合力が弱く、非特異的なL-DNA-Inputの放出が問題となった。そこで、SNAとL-DNA-Inputを連結させる設計に変更した。この設計においてはSNA/L-DNA-Input二重鎖が分子内で形成されるため、非特異的な解離が抑制される。また、標的との結合によりL-DNA-Inputが一本鎖に解離してもSNAと連結されているため、標的の位置特異的に回路を作動させることができ、よりイメージングに適していると考えられる。結合部の長さが異なるSNA/L-DNA-Inputコンジュゲートを作成し機能評価を行った結果、結合部が16塩基対の場合において、標的非存在下でSNA/L-DNA-Input二重鎖を形成し、標的添加によりL-DNA-Inputが一本鎖に解離する様子が確認された。このことから、新たな設計のSNA/L-DNA-InputコンジュゲートがRNAシグナルをL-DNAシグナルへと変換できることが示された。次に、増幅回路側の検証も行った。モデルとしてD-DNAを用いて、Inputに応答するHCR回路を設計した。配列長を様々検討した結果、stemとloop(toehold)それぞれ8残基の場合に効率のよい蛍光シグナル増幅が見られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

設計の変更はあったが、最終的にSNAとL-DNA-Inputを連結させることで標的RNAに特異的に応答してL-DNA-Inputシグナルを発生させるシステムが構築できた。また、増幅回路の検証実験にも成功しており、研究は計画通りに進展している。

今後の研究の推進方策

D-DNAで検証した配列設計を用いて、L-DNA増幅回路を合成する。SNA/L-DNA-InputコンジュゲートとL-DNA増幅回路を系中で混在させ、標的RNAからL-DNA-Inputへのシグナル変換と、それによるL-DNAシグナル増幅回路の起動を行う。つまり、標的RNAに応答し増幅された蛍光シグナルを発生できることを確認する。最終的には、細胞内や細胞抽出液中でのRNA検出を目指す。

次年度使用額が生じた理由

設計変更に伴い、消耗品の購入量が予定より減少した。次年度の消耗品購入に使用し、予定していた実験をさらに充実させる。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2018

すべて 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件)

  • [学会発表] Design of novel fluorescent probe with fluorescent nucleobase on artificial acyclic nucleic acid2018

    • 著者名/発表者名
      Keiji Murayama, Hiroyuki Asanuma
    • 学会等名
      International Symposium on Photochemistry (27th PhotoIUPAC)
    • 国際学会
  • [学会発表] 修飾核酸塩基導入による人工核酸SNAの高機能化2018

    • 著者名/発表者名
      村山恵司, 山野雄平, 浅沼浩之
    • 学会等名
      第6回バイオ関連化学シンポジウム若手フォーラム
  • [学会発表] 蛍光性核酸塩基導入による非環状型人工核酸プローブの開発2018

    • 著者名/発表者名
      村山恵司, 浅沼浩之
    • 学会等名
      第67回高分子討論会

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公開日: 2019-12-27  

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