細胞内外で活性をスイッチする機能性核酸のIn-cell NMR法等を用いた創製

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K14515
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 山置 佑大 京都大学, エネルギー理工学研究所, 研究員 (00778095)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 四重鎖核酸 / in-cell NMR / リボザイム / アプタマー / カリウムイオン

研究実績の概要

GGA繰り返し配列を有するRNAはカリウムイオン(K+)存在条件下でコンパクトなグアニン四重鎖構造を形成する。このGGA繰り返し配列と酵素活性を示すRNA(リボザイム)配列ないしは標的捕捉活性を示すRNA(アプタマー)配列を同時に有する機能性RNAは、K+を感知してグアニン四重鎖構造を形成する。このK+依存的な構造変化によって、これらの機能性RNAは自らの酵素活性や標的捕捉活性をオフからオンへと切り替えることが可能である。生体内においては細胞外のK+濃度が約5 mMであるのに対し、細胞内では約100 mMと高濃度に保たれている。したがって、上記のようなK+応答性の機能性核酸は細胞外では自らの機能をオフに保ち、働くべき場所(細胞内)でのみ K+を感知して自律的に活性をオンへと切り替え可能な新規機能性核酸となり得る。
平成31年度は細胞内のような様々な生体分子が混在する環境下で標的捕捉活性を有する機能性核酸の構造および活性を評価した。HIVウイルスのTatタンパク質を補足する機能性RNAであるTat捕捉アプタマーに関し、HeLa細胞破砕液存在下、非存在下でNMRスペクトルを測定した。Tat補足アプタマーのNMRスペクトルは、様々な夾雑生体分子の存在下であっても細胞破砕液非存在下と良く似ていた。これは細胞破砕液中においてTatを補足するために必要なバルジ構造を有するステムループ構造が保持されていることを示している。また、結合活性に直接関与しないステムの末端数残基のみに化学修飾を加えることで機能性核酸の分解を抑制可能であることも示唆された。さらにTat補足アプタマーとTatペプチドの複合体についても細胞破砕液中でNMRスペクトルを測定し、複合体の形成を示した。これにより、細胞破砕液中という分子夾雑環境においてもTat補足アプタマーが標的補足活性を発揮可能であることが示された。

研究成果

• [雑誌論文] RNA sequence and length contribute to RNA-induced conformational change of TLS/FUS (2020)
  • 著者名/発表者名: Nesreen Hamad, Tsukasa Mashima, Yudai Yamaoki, Keiko Kondo, Ryoma Yoneda, Takanori Oyoshi, Riki Kurokawa, Takashi Nagata, Masato Katahira
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 2629
  • DOI: 10.1038/s41598-020-59496-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Recent progress of in-cell NMR of nucleic acids in living human cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Yudai Yamaoki, Takashi Nagata, Tomoki Sakamoto, Masato Katahira
  • 雑誌名: Biophysical Reviews 巻: ― ページ: ―
  • DOI: 10.1007/s12551-020-00664-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Versatility of RNA-Binding Proteins in Living Cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa R., Takeuchi A., Shiina N., Katahira M., Yamashita T., Matsuno Y., Hitachi K., Ishigaki S., Hamad N., Yoneda R., Ueda N., Iida K., Hosokawa M., Hagiwara M., Iida M., Mashima T., Yamaoki Y., So M., Nagata T., Sobue G., Kondo K., Watanabe H., Uchihashi T.
  • 雑誌名: Biomedical Sciences 巻: 5 ページ: 7-13
  • DOI: 10.11648/j.bs.20190501.12
  • オープンアクセス
• [学会発表] In-cell NMR法を用いた非標準構造を形成する核酸の構造安定性の解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 阪本知樹, 山置佑大, 加納ふみ，村田昌之，永田崇, 片平正人
  • 学会等名: 第100回日本化学会年会
• [学会発表] Disruption of the Alzheimer's disease-related complex betweeen prion and amyloid b by an anti-prion aptamer (2019)
  • 著者名/発表者名: T. Mashima, M. Iida, Y. Yamaoki, M. So, T. Nagata, M. Katahira
  • 学会等名: Commemorative International Symposium of the Japan Society of Nucleic Acids Chemistry (CISNAC)
  • 国際学会
• [学会発表] In-cell NMR法を用いたヒト生細胞内の核酸の構造と安定性の評価 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山置佑大, 永田崇，清石彩華，三宅雅之，Lin Kuan-Heng, 高見昇平, 加納ふみ，村田昌之，片平正人
  • 学会等名: 第21回日本RNA学会年会
• [学会発表] The observation of in-cell NMR signals of nucleic acids in living human cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. Yamaoki, A. Kiyoishi, M. Miyake, K. H. Lin, F. Kano, M. Murata, T. Nagata, M. Katahira
  • 学会等名: 7th International Meeting on Quadruplex Nucleic Acids
  • 国際学会
• [学会発表] Evaluation of the structure and dynamics of nucleic acids inside the living human cells by in-cell NMR spectroscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. Yamaoki, T. Nagata, A. Kiyoishi, M. Miyake, F. Kano, M. Murata, M. Katahira
  • 学会等名: 第57回日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Development of anti-prion RNA aptamers and destruction of the Alzheimer's disease-related complex (2019)
  • 著者名/発表者名: T. Mashima, M. Iida, J. H. Lee, Y. Yamaoki, M. So, Y. O. Kamatari, T. Hayashi, M. Kinoshita, K. Kuwata, T. Nagata, M. Katahira
  • 学会等名: International Symposium on Nucleic Acids Chemistry 2019(ISNAC2019)
  • 国際学会
• [学会発表] In-cell NMR法を用いたヒト生細胞内のDNAおよびRNAの構造安定性評価 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山置佑大，永田崇，高見昇平，阪本知樹，片平正人
  • 学会等名: 第58回NMR討論会
• [学会発表] Promotor associated non-coding RNA, pncRNA, can diminish the aggregation of TLS caused by shearing stress (2019)
  • 著者名/発表者名: N. Hamad, T. Mashima, Y. Yamaoki, K. Kondo, R. Yoneda, R. Kurokawa, T. Nagata, M. Katahira
  • 学会等名: 第42回分子生物学会
• [学会発表] In-cell NMR法によるヒト生細胞内の核酸の構造およびダイナミクスの解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山置佑大, 永田崇, 阪本知樹, 高見昇平, 加納ふみ, 村田昌之, 片平正人
  • 学会等名: 第42回分子生物学会
• [学会発表] In-cell NMR法によるヒト生細胞内における核酸‐リガンド相互作用の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高見昇平, 山置佑大, 加納ふみ，村田昌之，坂本秦一，原田和雄，永田崇, 片平正人
  • 学会等名: 第42回分子生物学会
• [学会発表] ヒト生細胞内における核酸の非標準構造および構造安定性のin-cell NMR法を用いた解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 阪本知樹, 山置佑大, 加納ふみ，村田昌之，永田崇, 片平正人
  • 学会等名: 第42回分子生物学会