| 研究課題/領域番号 |
17K14520
|
|---|
| 研究機関 | 徳島文理大学 |
|---|
研究代表者 |
服部 良一 徳島文理大学, 薬学部, 助教 (60778140)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | 生体機能化学 / 物理系薬学 / タンパク質工学 / ケミカルバイオロジー / NMR |
|---|
| 研究実績の概要 |
副作用の強い抗がん剤にとってドラッグデリバリーの重要性は高く、がん細胞に特異的かつ高薬理活性を実現するデリバリーシステムの開発は急務である。本研究では、がん細胞に高発現する受容体を介した高効率な能動輸送による細胞内侵入が可能なジフテリア毒素タンパク質（その無毒変異体）に薬剤分子を化学的に修飾し、ドラッグデリバリーシステムへ応用する。ジフテリア毒素をはじめとした毒素タンパク質は細胞膜上の受容体を介した細胞内侵入およびエンドソームからの脱出能を有しており、薬剤分子のキャリアーとして適した性質を有する。その応用のため、ジフテリア毒素タンパク質と薬剤分子となる低分子化合物やタンパク質および核酸の連結法を確立する。また、所属研究室にて触媒機構解析を進めている塩基除去修復酵素OGG1を標的とした薬剤の細胞内導入に適用する。さらに、遺伝子工学的手法によるジフテリア毒素タンパク質の機能付加・改変をおこなう。具体的には、局在化シグナルの付加等による細胞内局在の制御や、受容体結合ドメインの置換による細胞特異性の改変にとりくむ。
平成29年度は、モデル系としてジフテリア毒素タンパク質を蛍光標識し、細胞内導入効率を検証した。ジフテリア毒素感受性が高い培養細胞株であるVero細胞に投与したところ、高効率な細胞内導入が観察された。さらに、遺伝子治療薬となる核酸分子への応用を目的として、蛍光標識したDNAとジフテリア毒素タンパク質の連結法を検討し、高効率で連結体を合成することに成功した。今後は、遺伝子発現の抑制が可能なsiRNAといった核酸分子を連結し、その細胞内導入および活性発現を評価する。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
毒素タンパク質をキャリアーとした細胞内導入については、ジフテリア毒素を含めいくつか報告例があるものの、遺伝子的に融合したタンパク質およびDNA結合性タンパク質を用いた遺伝子の導入に応用された例がほとんどである。本研究では、ジフテリア毒素タンパク質において無毒変異体が見出されていること、および細胞質に移行するドメイン内に部位特異的な化学修飾が可能なアミノ酸残基が存在することを着想にした。さらに、キャリアーとなるジフテリア毒素タンパク質と薬剤分子を共有結合によって連結することにより、低分子化合物や核酸を含めた種々の薬剤分子への応用を視野に入れている。
現在までに、ジフテリア毒素タンパク質の無毒変異体を蛍光分子FITCのヨードアセトアミド誘導体によって標識し、培養細胞株を用いた実験によって標識体の高効率な細胞内導入が確認された。また、ジフテリア毒素のエンドソームから細胞質への移行にはドメイン間のジスルフィド結合形成が重要であると考えられているが、還元剤で処理した場合には凝集した蛍光が観測され、細胞質移行されていないことが示唆された。さらに、エンドソームでの弱酸性pHにおいて細胞質の中性pHよりも強い蛍光をしめすAcidiFluorの標識体を用いた細胞実験により、エンドソームから細胞質へ移行したジフテリア毒素を識別することに成功した。
ジフテリア毒素のHis21はヨードアセトアミド基と特異的に反応することが知られている。そこで5’-アミノ修飾DNAをヨードアセトアミド化したのち、ジフテリア毒素と反応させたところ、高効率な修飾体の生成が確認された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
これまでに蛍光標識したジフテリア毒素（無毒変異体）の細胞内導入実験および、ヨードアセトアミド基を反応基とした核酸分子との連結法を確立した。今後はsiRNAといった機能性核酸の細胞内導入に応用し、カチオニックリポソームを用いた導入法と比較する。
キャリアーとなるジフテリア毒素については、大腸菌組換え発現による調製および遺伝子工学的手法による機能付加・改変にとりくむ。大腸菌組換え発現においては、可溶性・収量向上のために可溶化タグおよび宿主となる大腸菌株を検討する。機能付加・改変の方針としては、細胞内局在制御を目的として、核あるいはミトコンドリアへの局在化・輸送シグナル配列を付加する。またジフテリア毒素の受容体結合ドメインを別のリガンドに置換し、細胞特異性を改変する。具体的にはTGF-α/インターロイキン-2/抗体Fvなどへの置換により、種々のがん細胞へ特異性をもたせる。
他の遺伝子改変として、細胞質へ移行するドメインを欠損させたジフテリア毒素を調製し、これと薬剤分子をジスルフィド結合にて連結させる。細胞内の還元的環境ではジスルフィド結合が切断され、薬剤分子がジフテリア毒素から遊離し、細胞質へ拡散することが期待される。また別種の方策として、システイン変異を含むユビキチンとジフテリア毒素の融合体を調製し、あらかじめユビキチンと薬剤分子を連結させる。細胞内の脱ユビキチン化酵素によってユビキチンがジフテリア毒素から遊離し、薬剤分子を連結したユビキチンが細胞質へ拡散することが期待される。
上記で示したジフテリア毒素タンパク質を基盤とする薬剤分子の化学修飾や遺伝子工学的な機能付加・改変によって、さまざまに機能化されたドラッグデリバリーシステムを開発する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子組換え申請の関係から、本年度以降にさまざまな遺伝子構築およびタンパク質の組換え発現・精製を予定しており、そのための試薬・解析費用にあてる。
|
