| 研究課題/領域番号 |
17K14865
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
眞下 泰正 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (20707400)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | タンパク質導入 / 転写因子 / MyoD / 電界紡糸法 / ファイバー |
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| 研究実績の概要 |
ES/iPS細胞から分化細胞へ安全・安定・高効率に誘導するプロセス開発は喫緊の課題である。近年、転写因子の強制発現により、栄養因子を最適化した通常の分化プロセスに比べ非常に短い時間で高純度の目的分化細胞作製が可能であることが明らかとなった。先行研究では遺伝子導入による転写因子強制発現を行っていたが、本申請では「タンパク質」を直接導入することにより、更に高効率かつ簡便な分化プロセス開発を試みる。また、転写因子をはじめとする液性因子を細胞外マトリックス（ECM）と一体化することにより、液性因子の安定性、及び、細胞移行能の向上を狙う。
平成29年度では、骨格筋細胞分化に働くMyoD転写因子タンパク質を大腸菌発現系より単離精製した。得られたMyoDタンパク質の機能については、代表的な筋芽細胞株C2C12細胞を用いて行った。MyoDタンパク質を添加することにより、骨格筋様組織の形成が促進されたことにより、その機能を確認した。
また、骨格筋細胞分化を促進する配向性が揃った表面構造を有するECMを開発するため、本年度は電界紡糸法によりマイクロ～ナノスケールの構造を有するファイバーの作製条件を検討した。ファイバーの材料としては骨格筋分化に適したコラーゲンを酸溶媒に溶解し、平均直径400 nmに制御されたファイバー状の構造を得た。架橋した当コラーゲンファイバーは数日間の細胞培養後でもその構造を保持し、コラーゲンと同程度の細胞接着能を示した。
さらに現在、MyoDタンパク質とECMの一体化のため、ECMのコラーゲンコーティング条件の検討とMyoDタンパク質へのコラーゲン結合ドメインの融合を試みているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究計画の通り、骨格筋細胞分化を誘導する材料の作製及び評価が完了しつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度では、MyoDタンパク質及びファイバー状のECM材料の評価を、マウスiPS細胞の骨格筋分化の成熟度を指標に行っていく。本研究は、「短時間」かつ「簡便」な分化誘導方法の確立を特色とするため、胚様体を形成させず単層培養条件における誘導条件を検討していく。
液性因子をECMに固定化するためのアンカーとなるコラーゲン結合ドメインに関しては、引き続き検討を行っていく。現在、フィブロネクチン由来の配列がコラーゲン結合能を示すデータを得ているが、他にもコラゲナーゼ・vWF・胎盤由来成長因子に由来する結合ドメインが報告されており、これらの結合能評価も行い、さらには異種配列を組み合わせることによる結合力強化等を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度はタンパク質材料及びファイバー材料の構築が主目的であり、それらの実験自体が消耗品の出費が少ないものである他、それぞれ別のプロジェクトの研究と共通の試薬を使用出来たため予算の支出を抑えることができた。次年度では、準備した材料をマウスiPS細胞を使用して評価（遺伝子発現・表現型解析）していくうえで大幅な出費が予想されるため、今年度の予算を次年度に向けて多く残した意図もある。
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