| 研究課題/領域番号 |
17K14867
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
金岡 英徳 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (30631973)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | トランスジェニックニワトリ / CRISPR/Cas9 / インフルエンザワクチン / 糖鎖改変 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術により、ニワトリ始原生殖細胞(PGC)の糖転移酵素を改変し、ニワトリ本来のα2,3結合シアル酸からヒ ト型のα2,6結合シアル酸に置き換え、よりインフルエンザワクチンの生産に適した鶏卵を開発することを目的としている。初年度は、ニワトリPGCにゲノム編集 を行うためのプラスミド構築と遺伝子導入法の検討を主に行った。
昨年度に作製したプラスミドベクターをニワトリPGCへ導入した。ゲノム編集が成功すると内在性ST3Gal6のプロモーター活性により、レポーターであるeGFP蛍光が観察されるはずだったが、蛍光を持つ細胞は観察されなかった。理由として、エレクトロポレーションによる遺伝子導入効率が低いため、ゲノム編集効率が悪いことやST3Gal6のプロモーター活性が予想以上に低く、eGFPの発現が弱くなってしまった可能性が考えられる。
これらの問題を解決するために遺伝子導入効率を上げるためにリポフェクションによる遺伝子導入法を改良し、エレクトロポレーション法と比較して細胞へのダメージを減らし、且つ高効率に導入できる条件を見出した。また、eGFPの発現方法を内部プロモーターから強力な外部プロモーターへ変更し、細胞のセレクション効率の上昇を試みている。さらに一般的にプラスミドでCas9を発現させる方法より効率が良いとされるCas9タンパク質とin vitro transcriptionで合成したguide RNAを用いて、ゲノム編集効率を上昇させる試みも行なっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初研究計画のエレクトロポレーションによる遺伝子導入法とベクターコンストラクトでは遺伝子導入効率が低く、ゲノム編集された細胞の分離が困難であったため、リポフェクションによる遺伝子導入法の改良とレポーター遺伝子発現法の見直しを行なった。リポフェクションの条件検討により、遺伝子導入時の細胞へのダメージを減少させ、導入効率を大幅に上昇させることに成功したため、現在新たな条件でニワトリPGCへのゲノム編集を行なっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請書の実験計画に基づいて、以下の検討項目課題を行う。
・作製したベクターを用いてニワトリPGCの糖転移酵素遺伝子のゲノム編集を行い、PGC株を樹立する。
・樹立したPGCの表現型の解析を行い、糖転移酵素改変の確認を行う。
・樹立したPGCを移植し、生殖細胞キメラニワトリを作製する。
・生殖キメラニワトリを交配して、G1トランスジェニックニワトリを作製する。
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