| 研究課題/領域番号 |
17K14950
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山田 真弓 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50583457)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ニューロン新生 / 神経幹細胞 / RNAシークエンス / 側脳室周囲 / 海馬歯状回 / 遺伝子発現プロファイリング / FACS |
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| 研究実績の概要 |
中枢神経系において、神経細胞（ニューロン）は胎生期から出生後しばらくの時期にのみ、神経幹細胞から生み出されると考えられてきた。しかし、最近の研究によって、ヒトを含めたほ乳類の成体脳においても、側脳室周囲の脳室下帯や海馬の歯状回といった特定の領域では神経幹細胞が存在し、ニューロン新生が継続的に続いていることが分かってきた。
本研究では、神経幹細胞の性質を制御する分子実体を明らかにするために、胎生期から生後・成体期までのさまざまなステージにおいて大規模なRNAシークエンスを行い、遺伝子発現プロファイリングを行った。具体的には、神経幹細胞を蛍光タンパク質で標識するトランスジェニックマウスを作製して、FACSにより脳内から神経幹細胞を採取した。これらの細胞を用いて、RNAシークエンスを行なった。次にRNAシークエンスの結果から、発生・発達・加齢に伴う遺伝子発現の変動を解析した。データベースや論文の情報も加味し、特に成体期において加齢に伴い増加あるいは減少する遺伝子の中で、ニューロン新生に関与し得るものをリストアップした。さらに、ニューロン新生への関与についての報告はないが、加齢に伴い増加あるいは減少する遺伝子についても抽出することができた。今後は、これらの候補遺伝子について機能解析を行う予定である。
さらに、遺伝子発現プロファイリングと並行して、候補遺伝子の機能解析を行うための実験系の確立も行った。高純度かつ高いタイターのレンチウイルスやアデノ随伴ウイルス(AAV)を作製するプロトコールを確立し、マウス脳内にインジェクションすることによって、目的の遺伝子の強制発現が可能になった。来年度以降は、遺伝子発現プロファイリングで選択した遺伝子の機能解析を行い、ニューロン新生やニューロン分化制御に関与するものを同定する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、RNAシークエンスを行うために、マウスのさまざまなステージにおいて数十匹のダブルあるいはトリプルトランスジェニックマウスが必要となるため、マウスの準備が律速段階となる。そこで、シングルセルを用いたRNAシークエンス方法を参考にし、数匹のマウスからRNAシークエンスを行う方法を確立することができた。この方法により、当初の予定通りに解析を実施することができた。読み終えたRNAシークエンスについては、既存データベースや文献を参考にしながら、遺伝子発現プロファイルの解析を行った。この結果、ニューロン新生に関与し得る複数の遺伝子を絞り込むことができた。さらに、選択した遺伝子について、機能解析を行うための実験系の準備も順調に行うことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、マウスの胎児期から成体期までのさまざまなステージにおいて、神経幹細胞の大規模な遺伝子発現プロファイリングを実施することができた。さらに、各ステージにおける遺伝子発現を比較し、発現変動が大きい遺伝子の中から、特に成体脳においてニューロン新生に関与し得る遺伝子候補を選択することができた。今後はreal-time RT-PCRやin situ hybridization法などにより、それぞれの発現部位を確認し、さらに候補遺伝子を絞る。次に、候補遺伝子を発現するレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを作製する。まずは、培養神経幹細胞や初代培養神経細胞などを用いて、候補遺伝子の機能解析を行う。さらに、海馬歯状回にウイルスをインジェクションし、in vivoにおいて機能解析を行う予定である。これらの解析を通じて、発生・発達・加齢に伴い、どのようにして神経幹細胞の性質が制御されているのかを解析したい。将来的には、アルツハイマーなどの神経疾患の脳機能改善に貢献できればと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では、マウス脳内から神経幹細胞を採取するために数百匹のトランスジェニックマウスが必要であったが、数十匹のマウスでも解析を行うことが可能になったため、当初の計画よりも少ない予算でマウスの準備を行うことができた。また、予定通りRNAシークエンスも終えることができたので、本年度の助成金の残金は、RNAシークエンス解析で得られた複数の遺伝子の機能解析に活用する予定である。具体的には、機能解析のために、レンチウイルスやアデノ随伴ウイルスを作製するためのトランスフェクション試薬、ウイルス精製試薬、または、マウスの購入に使用する予定である。
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