| 研究課題/領域番号 |
17K14953
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| 研究機関 | 川崎医科大学 |
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研究代表者 |
中村 悠 川崎医科大学, 医学部, 助教 (70535484)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 梨状皮質 / シンドビスウイルス / ウイルスベクター / 逆行性トレーサー / 嗅球 / 嗅覚 / 投射様式 / 軸索分岐 |
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| 研究実績の概要 |
梨状皮質は嗅球で処理された匂い情報を受け取り、様々な脳領域へ伝達する。梨状皮質内には樹状突起の形状が異なる複数の投射ニューロンが存在しているが、各ニューロンの投射様式はよく分かっていない。近年開発が進められているウイルスベクターは、少数のニューロンを選択的に標識することが可能であり、脳内の多くの部位で新しい知見が報告されている。特に、シンドビスウイルスベクターは、発現力が非常に強いプロモーターを有しているため、従来の順行性トレーサーよりも短時間でニューロンを標識することができる。また、膜移行シグナルを付加した蛍光タンパク質を発現させることにより、標識ニューロンをゴルジ染色用に隅々まで可視化することが可能になった。本申請課題では、このシンドビスウイルスベクターを用いて梨状皮質の投射ニューロンを標識し、樹状突起の形態と軸索分岐様式の関係性を明らかにする。
一方、梨状皮質と他の嗅覚関連領域との神経連絡は、多くが双方向的であることが知られている。嗅覚系伝導経路の理解を目指すにあたり、梨状皮質ニューロンがどのような情報を受け取るのかという点も重要な問題である。嗅球出力細胞の投射様式については、近年明らかにされたが、嗅球以外の脳領域から梨状皮質への入力様式についてはまだ十分に解析されていないのが現状である。そこで、梨状皮質内に逆行性トレーサーを注入する実験を行ったところ、興味深い所見が得られた。今後、シンドビスウイルスベクターによる順行性標識により、逆行性トレーサーの所見をさらに検討していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本申請課題の目的は、嗅覚情報処理に関わる脳内の神経回路網を明らかにすることである。当初は梨状皮質の投射ニューロンを標識し、その軸索分岐を解析するというアプローチを中心に課題を遂行する予定であったが、梨状皮質のニューロンが受け取る情報についても検討を行った。梨状皮質へ逆行性トレーサーを注入し、標識された神経細胞の脳内分布を解析した結果、興味深い所見が得られたため、現在は梨状皮質への入力様式の解析を優先している。また、当該年度は、逆行性標識細胞の解析、シンドビスウイルスベクターによる細胞標識した脳標本の作製に想定以上の時間を要した。これらの理由により、研究計画に変更及び遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は梨状皮質への入力様式を優先して解析した後に、梨状皮質からの投射様式について本格的に研究を進める予定である。具体的には、神経細胞の逆行性標識に加えて、シンドビスウイルスベクターによる順行性標識を行い、梨状皮質への投射様式を解析していく。その実験手順は以下の通りである。
１． マウス（10週齢、C57BL/6J）を麻酔下で脳定位装置に固定し、シンドビスウイルスベクターを含む希釈溶液を空気圧により脳内へ注入する。２．灌流固定したマウスから脳を摘出し、凍結切片を作製する。３．蛍光顕微鏡下で感染細胞の樹状突起や細胞体を観察する。４．免疫組織化学染色法により、投射ニューロンの軸索線維を可視化する。
ウイルスベクターを注入する際には、毎回の注入量を極力一定にするため、圧注入法を用いる。脳の領域、神経細胞種により、ウイルスベクターの感染性が異なる可能性があるため、ウイルス溶液の濃度や注入量を適切に設定する必要があるが、当該領域で数個だけ感染するような注入条件は設定済みである。また、手順４における抗体濃度、染色時間、シグナル増感法についても適切な条件について検討済みである。この一連の条件検討の一部は、梨状皮質ニューロンを標識する際にも適用できる。一方、当該領域が小さいため、目的の部位の細胞が感染した標本を得るまでに、想定以上の労力を要した。引き続き、標本作製を続けていく必要がある。梨状皮質への入力様式の解析が進んだ後、梨状皮質からの投射様式の研究へ速やかに移行する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本申請課題では、梨状皮質への神経入力様式や梨状皮質ニューロンの投射様式を明らかにし、高次嗅覚中枢における神経回路網の理解を目指す。当該年度は、逆行性標識細胞の解析、シンドビスウイルスベクターで標識した脳標本の作製に時間を費やしたため、研究計画に遅れが生じ、次年度使用額が生じた。 次年度は梨状皮質の入出力様式について、シンドビスウイルスベクターを用いた解析を進める。次年度使用額は30年度交付額と合わせ、ウイルスベクターの脳内注入実験や、感染細胞の可視化に必要な試薬等の消耗品、また、実験を効率化するための機器等に使用する予定である。
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