| 研究課題/領域番号 |
17K14953
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
中村 悠 久留米大学, 医学部, 助教 (70535484)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 梨状皮質 / シンドビスウイルス / ウイルスベクター / 逆行性トレーサー / 嗅球 / 投射様式 / 軸索分岐 |
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| 研究実績の概要 |
梨状皮質は嗅球で処理された匂い情報を受け取り、様々な脳領域へ伝達する。梨状皮質内には樹状突起の形状が異なる複数の投射ニューロンが存在しているが、各ニューロンの投射様式はよく分かっていない。近年開発が進められているウイルスベクターは、少数のニューロンを選択的に標識することが可能であり、脳内の多くの部位で新しい知見が報告されている。特に、シンドビスウイルスベクターは、発現力が非常に強いプロモーターを有しているため、従来の順行性トレーサーよりも短時間でニューロンを標識することができる。また、膜移行シグナルを付加した蛍光タンパク質を発現させることにより、標識ニューロンをゴルジ染色用に隅々まで可視化することが可能になった。本申請課題では、このシンドビスウイルスベクターを用いて梨状皮質の投射ニューロンを標識し、樹状突起の形態と軸索分岐様式の関係性を明らかにする。
一方、梨状皮質と他の嗅覚関連領域との神経連絡は、多くが双方向的であることが知られている。嗅覚系伝導経路の理解を目指すにあたり、梨状皮質ニューロンがどのような情報を受け取るのかという点も重要な問題である。嗅球出力細胞の投射様式については、近年明らかにされたが、嗅球以外の脳領域から梨状皮質への入力様式についてはまだ十分に解析されていないのが現状である。そこで、梨状皮質内に逆行性トレーサーを注入する実験を行ったところ、興味深い所見が得られた。順行性標識による更なる解析を試みたが、シンドビスウイルスベクターを用いた標識に問題が生じ、その対策を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本申請課題の目的は、嗅覚情報処理に関わる脳内の神経回路網を明らかにすることである。当初は梨状皮質の投射ニューロンを標識し、その軸索分岐を解析するというアプローチを中心に課題を遂行する予定であったが、梨状皮質のニューロンが受け取る情報についても検討を行った。梨状皮質へ逆行性トレーサーを注入し、標識された神経細胞の脳内分布を解析した結果、興味深い所見が得られたため、現在は梨状皮質への入力様式の解析を進めている。当該年度は、シンドビスウイルスベクターによる細胞標識法において生じた問題点の対策と、研究施設の変更のため、再度条件検討を要した事等により、想定以上の時間を要した。これらの理由により、研究計画に変更及び遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
シンドビスウイルスベクターを注入する際には、毎回の注入量を極力一定にするため、圧注入法を用いる。脳の領域、神経細胞種により、ウイルスベクターの感染性が異なる可能性があるため、ウイルス溶液の濃度や注入量を適切に設定する必要があるが、当該領域で数個だけ感染するような注入条件は設定済みである。また、ウイルスによる神経標識に必要な時間にも、実験系によっては想定以上に大きく異なることが明らかになった。
対象とする脳の領域が小さいため、目的の部位の細胞が感染した標本を得るまでに、想定以上の労力を要したのに加え、軸索線維を完全に標識するために、ウイルス注入から動物を固定するまでの生存時間を再度検討する必要が生じた。計画に遅延が生じているが、最適な神経標識条件の確認は完了している。また、研究実施場所の変更に伴う、免疫組織化学染色における抗体濃度、染色時間、シグナル増感法等の至適条件の再設定も終えており、今後はウイルスで標識された神経線維の解析を行っていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本申請課題では、梨状皮質への神経入力様式や梨状皮質ニューロンの投射様式を明らかにし、高次嗅覚中枢における神経回路網の理解を目指す。当該年度は、シンドビスウイルスベクターによる細胞標識法において生じた問題点の対策と、研究施設の変更のため再度条件検討を要した事等により、想定以上の時間を費やした。そのため、研究計画に遅れが生じ、次年度使用額が生じた。次年度は梨状皮質の入力様式について、シンドビスウイルスベクターを用いた解析を進める。次年度使用額は、感染細胞の可視化に必要な試薬等の消耗品、また、実験を効率化するための機器等に使用する予定である。
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