| 研究課題/領域番号 |
17K14979
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| 研究機関 | 公益財団法人実験動物中央研究所 |
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研究代表者 |
高橋 司 公益財団法人実験動物中央研究所, 応用発生学研究センター, 研究員 (90571175)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | マーモセット / トランスジェニック / piggyBac |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではトランスポゾンであるpiggyBacを用いた新規Transgenic(Tg）マーモセットの作出技術の確立を試みる。piggyBacの末端逆位配列（ITR:inverted terminal repeats）内の遺伝子のみが宿主遺伝子に挿入される特性を生かし、導入遺伝子部分であるITR内側と非導入部分であるITR外側に発光と蛍光の別々のレポーター遺伝子を搭載することで、その発現の切替わりにより遺伝子導入の有無を判別する。本技術をTgマーモセット作製に応用し、胚の段階で遺伝子導入を選別し移植することで、産仔全てがTg個体となることを目指す。
平成29年度は蛍光・発光選抜piggyBacベクターの構築を行った。まずpiggyBacの非導入部分であるITR外側にCMVプロモーター下にhKO1（humanaized-Kusabira-Orange1）を配置し、ITR内側の導入部分には目的遺伝子に発光遺伝子（cp156Venus-Luciferasse2）を連結させた。まずコントロールとしてレポーター遺伝子のみCMV-hKO-PB-CAG- cp156Venus-Luciferasse2 を作製し、続いてパーキンソン病の原因遺伝子であるLRRK(G2019S)を導入したCMV-hKO1-PB-CAG-LRRK2 (G2019S)-2A-cp156Venus-Luciferasse2 を作製した。また、次年度よりマウス胚を用いた実験を行う予定のため、マウスの飼育環境の整備を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の計画どおり、ベクターの構築は終了した。また、次年度の計画であるマウス胚を用いた実験のため、マウスの飼育環境を整備して飼育を始めた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度作製したベクターを細胞にトランスフェクションし、レポーター遺伝子の発現の切り替わりと遺伝子導入のタイミングを解析する。また卵子の希少なマーモセットの予備実験として、多数の卵子が使用できるマウスを用いてマイクロインジェクションの条件検討を行う。各レポーター遺伝子の発現の変化を指標として遺伝子導入胚の選別基準を定め、実際にマウスで選別した胚を移植し、ｔｇ作出効率と目的遺伝子の発現を評価する。以上のマウスの最適条件を用い平成31年度よりマーモットを用いて個体作製を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ベクター構築が比較的スムーズに終了したことや、マウス飼育のためのケージ等の備品を貸与していただいたため次年度使用額が生じた。次年度使用額は平成30年度のベクター評価のための試薬やマウス個体購入費に移行する。
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