| 研究課題/領域番号 |
17K15078
|
|---|
| 研究機関 | 立命館大学 |
|---|
研究代表者 |
北沢 創一郎 立命館大学, 薬学部, 助教 (50779030)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 高圧力 / NMR / リン酸化ユビキチン / 構造揺らぎ |
|---|
| 研究実績の概要 |
パーキンソン病関連タンパク質であるPINK1によりSer65がリン酸化されたリン酸化ユビキチンは、水溶液中で二つの天然状態(MajorとMinor)が存在し、水溶液中で7:3の割合で揺らいでいる。リン酸化ユビキチンはパーキンソン病関連タンパク質であるParkinを活性化させ、ミトコンドリアの品質管理にかかわる。また、リン酸化ユビキチンを模倣したリン酸化ユビキチン模倣変異体(S65E,S65D)はPINK1をバイパスしParkinを活性化させることが知られている。本研究ではMajorとMinorの構造の揺らぎがどのように機能に影響を与えているかを解明することを目的としている。昨年度までにリン酸化ユビキチン・関連蛋白質の精製方法の確立とコンホメーション変化に敏感な高圧力NMR法を用いた解析を行った。
構造揺らぎ研究についてはリン酸化ユビキチンの重水素交換NMR法及び水ーアミド水素交換反応速度NMR測定（CLEANEX-PM NMR）による測定を行った。重水素交換NMR法とCLEANEX-PM NMR法は交換反応速度の異なる領域を測定することが可能であり相補的な関係にある。それらから水分子交換の反応の圧力依存性から安定性を評価する方法の考案し、その手法の確立を野生型ユビキチンで行った。１から2500気圧までの範囲で測定を行った。それらの結果、これまで観測することが困難であった完全変性状態までの広いコンホメーション空間について熱力学的に一残基分解能で観測することに成功した。現在これらの結果をまとめている最中である。加えて、リン酸化ユビキチンについても測定をしている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
立体構造研究及び構造揺らぎ研究は遅れている。NOEによる距離情報と二面角情報と常磁性緩和促進法による距離情報を集め構造計算に応用する計画であった。しかし、昨年度までに常磁性プローブ導入のためシステイン残基を導入した複数のユビキチンのうち、ほとんどのユビキチン変異体でPINK１によるリン酸化反応が進行しなかった。リン酸化反応が進行した変異体について構造計算に導入し計算を行った。
構造揺らぎ研究についてはリン酸化ユビキチンの重水素交換NMR法による測定を新たに行った。いくつかの圧力について１カ月以上の測定を必要としたことから遅れが見られた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
高圧力水ーアミド水素交換反応測定によるリン酸化ユビキチンの構造揺らぎを進めている。これは高圧力NMR法の結果をサポートする重要な結果であり、広い圧力範囲で細かい圧力毎に解析が必要である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
一部実験機器の様子を見ていたため支出を控えていた。最終的に必要物品の購入計画を立てたところ一部企業の流通が止まってしまったため購入することができなかった。
これら昨年度購入することができなかった消耗品の購入に充てる計画である。
|
