| 研究実績の概要 |
本研究は、これまで研究を進めてきたXrn1にXrn2を加え、【熱ストレスによるXrn1, Xrn2活性化機構の解明】、【Xrn1, Xrn2の基質認識機構の解明】を目的に研究を進めている。2019年度は下記の課題を実施しました。
(1) 熱ストレスによりXrn1, Xrn2に結合するタンパク質の同定
熱ストレスによりXrn1, Xrn2に結合するタンパク質をプルダウン法と質量分析により同定を試みた。その結果、熱ストレスに依存してXrn1, Xrn2結合・解離するタンパク質を複数同定した。現在、これらのタンパク質がXrn1, Xrn2の活性に関与しているのか検討している。
(2) ヒトXrn1を用いたin vitro実験系の構築
ヒトXrn1, Xrn2を用いたin vitroにおけるRNA分解実験系は構築されていない。そのため、ヒト培養細胞にてN末にHalotagを融合したXrn1, Xrn2を過剰発現させ、精製を試みた。その結果、精製収量がかなり低いがXrn1, Xrn2を精製することができ、Xrn2に関しては基質である開始tRNAの分解をin vitroにて確認することができた。また、Xrn1, Xrn2の精製収量が低い原因として、熱ストレスによるHalotagの変性が問題であることも明らかになった。そこで、発現量・精製収量を改善するために、Halotagの代わりに様々なtagを融合したXrn1, Xrn2の発現・精製を試みたが、Halotagよりも発現量が低下したり、分解が起こるなどしたためXrn1, Xrn2の精製収量を改善することができなかった。現在、N末にHalotag、C末に異なるtagを融合することで改善することができるか試みている。
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