| 研究課題/領域番号 |
17K15106
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
松本 篤幸 神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (00753906)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | Ras / ダイナミクス / X線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
1．H-RasQ61L（1-166）のState 2の結晶化条件並びにHAG法を用いたState 2結晶からState 1結晶への遷移条件の最適化を行った。得られた良質なState 1結晶を用いて取得した回折データに基づいて立体構造決定を行った結果、研究開始当初に電子密度が観察されなかった領域についてモデルを構築することができた。
2．Rasに結合した加水分解抵抗性GTPアナログの31P NMR測定 によりH-RasQ61LのState 1/State 2占有比率の測定を行った結果、State 1の結晶構造から予想された通り、Q61L変異により有意にState 1の存在比率が増加していることが明らかになった。
3．溶液中で主にState 1状態で存在するH-RasQ61L/T35S について15N, 13C安定同位体標識体を調製し、NHシグナルの連鎖帰属を行うための一連の3次元NMR スペクトルを測定した。得られたスペクトルを解析した結果、プロリンを除く163残基全てについて帰属を行うことができた。さらに帰属結果に基づいて、L61周辺の運動性を1H-15N HSQC スペクトルを利用した緩和時間測定並びにヘテロNOE 測定により解析した。得られた運動性パラメーターをH-RasT35Sと比較した結果、有意な運動性の違いを検出することができなかった。
4．Q61Lと同様にがん変異体としてよく知られるQ61H変異体について、State 1の結晶構造解析を行うため、プライマーを設計しQuickChangeにより発現用ベクターを作成した。大腸菌発現系を利用して得られた高純度H-RasQ61Hサンプルを用いて結晶化を行い、HAG法を利用した回折実験を行うことで、State 1並びにState 2に対応する回折データを取得することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
H-RasQ61L変異体のState 1の結晶構造決定、並びにNMRによるH-RasQ61L/T35Sの溶液中での運動性の解析を完了した。このことから、平成29年度から平成30年度にかけて実施予定であったH-RasQ61L変異体に関わる実験・解析のほとんどを平成29年度中に終了することができた。緩和時間測定並びにヘテロNOE 測定実験からは当初想定していたQ61L変異によって引き起こされる運動性の変化を検出することはできなかったが、引き続き計算科学的アプローチによりがん変異がRasの分子内運動に与える影響の検出に取り組む。またH-RasQ61L変異体に関わる実験・解析が当初の想定以上の速度で完了したことから、平成30年度以降に実施する予定であったH-RasQ61H変異体に関わる実験に着手し、平成29年度中に立体構造決定に十分な分解能の回折データを既に取得している。以上のことから、本研究は当初の研究計画以上に進展していると判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度にH-RasQ61H変異体の結晶を用いて取得した回折データからState 1及びState 2それぞれのX線結晶構造決定を行う。その結果得られた結晶構造をすでに決定している野生型並びにQ61L変異体の結晶構造と比較し、61番目の残基の変異によって生じる立体構造の違いを抽出する。また平成29年度に実施した緩和時間測定並びにヘテロNOE 測定実験ではQ61変異によって引き起こされる運動性の違いを捉えることが困難であったため、野生型、Q61L変異体、Q61H変異体それぞれのState 1及びState 2の結晶構造を用いて大規模な分子動力学計算を実施することで、それぞれの分子種・構造状態における局所の動的特性の違いを検出する。得られたin silicoデータを既に取得済みの実験データと併せて解析することでがん変異体の機能の理解を進め、61番目の残基が変異することによって引き起こされるRasの生理機能不全に関わる分子メカニズムを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年度に実施した実験について技術的な問題が起こらず、当初想定していた以上の速度で期待していた成果を挙げることができたので、特に試薬類の購入費用や共同施設利用料が圧縮され、次年度使用額が生じることとなった。
平成29年度に実施したNMR実験ではQ61変異の分子内運動への影響を検出することができなかった。これにより全体の研究目的並びに研究計画が大きな影響を受けることはないが、野生型Ras並びにがん変異体の運動特性の理解はその機能解析において依然必要不可欠であり、他のアプローチによる実験系の構築が必須である。そこで平成30年度以降は高い処理能力を持ったコンピューターを利用した計算科学的手法により、野生型、Q61L変異体、Q61H変異体の局所の動的特性の違いを解析する。そのためには高度な計算科学的実験を行うための環境整備並びに情報収集を行う必要があり、それに対応する額の学術研究助成基金助成金を次年度に使用する。またこれまでの成果について、学会等を通じて社会に発信するための費用として使用する。
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