| 研究課題/領域番号 |
17K15148
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立環境研究所 |
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研究代表者 |
大田 修平 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 特別研究員 (20455926)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | オートファジー / 酸化ストレス / 重金属ストレス / 藻類細胞 / フリーズフラクチャー |
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| 研究実績の概要 |
本課題の達成目標は、植物型オートファゴソームのホスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）分子の局在をナノレベルで明らかにすることである。本研究ではフリーズフラクチャー法と免疫電顕法を組み合わせて、オートファゴソームの膜面におけるPI3P分子の局在を可視化することを試みている。本研究で得られたデータは先行研究の酵母や哺乳類細胞と比較し、植物型オートファジーに関する特徴を見出す予定である。初年度は、実験に使用する藻類株の選定を行った。本課題ではゲノムがすでに解読されている緑藻クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）および生態毒に鋭敏に応答する緑藻類であるムレミカズキモ（Pseudokirchneriella subcapitata）を用いることにした。いずれの株も国立環境研究所微生物系統保存施設より入手し、継代培養をしている。また、細胞がストレスを受けたときに生じる酸性コンパートメントの出現時期についてモノダンシルカダベリン等の蛍光試薬を用い、フローサイトメトリー、マイクロプレートリーダーおよび蛍光顕微鏡を用いたアッセイを行った。窒素飢餓、ラパマイシン曝露、重金属曝露等をストレス源として酸性コンパートメントの出現の有無を調査した。また、実際に上記2種の藻類細胞に対してフリーズフラクチャーを行い、固定の条件検討を行った。フリーズフラクチャー法で得られたレプリカ膜は、2.5 %ニクロム酸ナトリウム／50 %硫酸による細胞消化のほか、免疫電顕法で使用するためにドデシル硫酸ナトリウム溶液による細胞消化法も試している。さらに、先行研究に基づきPI3P分子を認識するPXドメイン（Phox相同性）をもつリコンビナントタンパク質を精製し、PIP strips アッセイにより精製タンパク質のPI3P分子に対する特異性について調べた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ホスファチジルイノシトール３リン酸分子を認識するタンパク質に関しては、先行研究に基づき、PI3P分子を認識するリコンビナントタンパク質を精製し、PIP strips アッセイによりタンパク質のPI3P分子に対する特異性を調べるところまで到達できた。また、フリーズフラクチャー法に関しては、藻類細胞の固定および観察の段階に到達できた。研究の進捗はおおむね計画通りである。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度に引き続き、フローサイトメトリー等を用いて藻類細胞における酸性コンパートメント出現時期を正確に把握する実験に取り組む。ストレス源として栄養塩飢餓や重金属曝露条件を検討する。フリーズフラクチャー電顕に関しては、通常の細胞消化法による観察を行うとともに、免疫電顕法で観察するための条件検討と実際の観察を行う予定である。フリーズフラクチャーレプリカにより捕捉されたPI3P分子を標識・可視化する系が確立できたら、電顕観察を継続し、定量的なデータ取得に努める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度は旅費や論文出版に関わる費用の支出がなかったので、差額が生じた。物品費についてはほぼ計画通りであった。今年度は引き続き免疫電顕による観察および分子生物学実験を予定している。実験に関わる消耗品や試薬代、論文投稿料として使用する予定である。
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