| 研究課題/領域番号 |
17K15152
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
山本 耕裕 大阪医科大学, 医学部, 助教 (20613558)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | PIWI-piRNA / 性分化 |
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| 研究実績の概要 |
メダカ性分化におけるPIWI-piRNAシステムの役割を明らかにするため、次世代シークエンサーを用いた網羅的解析とPIWIノックアウトメダカによる組織学的解析を行った。
網羅的解析では卵巣および精巣を用いてsmall RNAプロファイルと遺伝子発現状態の解析を行い、雌雄ともにpiRNAの特徴的な長さの小分子RNAが認められ、興味深いことにpiRNAの長さのプロファイルには雌雄差がみられた。次に、メダカゲノムへの小分子RNAのマッピングを行い、以下３点の雌雄差が認められるpiRNAを同定した。①：エクソン領域にマップされ、雌雄差が認められるpiRNA。②：トランスポゾンにマップされ、雌雄差が認められるpiRNA。③：piRNAクラスターと定義される領域で雌雄差が認められるpiRNA。
Piwil1とPiwil2の2つの遺伝子を欠損したノックアウトメダカをCRIS PR/Cas9により作製したところ、どちらのノックアウトメダカも不妊であり、興味深いことにPiwil1を欠損したXY個体では雄性分化に異常が認められた。異常が認められたPiwil1欠損個体の生殖腺では、性分化関連遺伝子の発現にも異常がみられた。
これらの結果から、PIWI-piRNAによる性分化への関わりが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ノックアウトメダカの解析からPIWIは性分化に関わルコとを示し、網羅的解析から性分化に関わると考えられる性特異的なsmall RNAを単離することが出来た。昨年度ではそれぞれのPiwi欠損個体における生殖細胞数と性分化関連遺伝子の発現を解析し、Piwil1とPiwil2が生殖細胞で働く時期、分化段階を特定することが出来たため、本年度はこれら特定した分化段階でのサンプリングを行い、ノックアウトメダカでの網羅的解析に繋げることが可能となった。また、網羅的解析のパイプラインも構築することが出来たため、ノックアウトメダカでの解析も容易になると期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
性分化に関わるpiRNAの同定を行うため、ノックアウトメダカにおける網羅的small RNA解析を行う予定である。そのため、メダカPIWIを特異的に認識する抗体の作製する。この抗体を用い、特定した分化段階の生殖細胞においてCLIP-seqを行うことにより、PIWIに結合するpiRNAを分離/同定を行う。野生型メダカとノックアウトメダカを比較することで、性分化に関わるpiRNAならびに標的遺伝子の単離を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は所属する研究室に既存の研究機器および消耗品を使用することができた。また、予算申請していた機器の代替となる研究機器を安価に購入することが出来たため、予定との差が生じた。
本年度は抗体作製、次世代シークエンサーの使用を考えているため、昨年度の予算を本年度に使用する予定である。
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