| 研究課題/領域番号 |
17K15231
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
出崎 能丈 明治大学, 研究・知財戦略機構, ポスト・ドクター (80711647)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | MAMP / キチン / ユビキチンリガーゼ / リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では我々が同定したシロイヌナズナキチン受容体CERK1の相互作用因子であるPUB4のキチンシグナル伝達における役割を明らかとすることを目指している。
これまでの研究で、PUB4変異体では内在のサリチル酸の増大が示唆されており、これが防御応答解析に影響を与えている可能性が考えられてきた。そこで本年度はまず、PUB4変異体における内在サリチル酸を定量した。その結果、PUB4変異体では野生型に比べて優位にサリチル酸が高蓄積していることが示された。そこで、既知のSA代謝系の変異体および過剰発現体とPUB4変異体の重複変異体の作出を掛け合わせにて試みた。これまでの所、両遺伝子がホモに挿入されていると考えられる個体を得るに至っている。
また、PUB4はCERK1からのリン酸化によって活性が制御されることが示唆されていた。そこで、本年度は大腸菌発現系で調製したPUB4タンパク質を用い、in vitroユビキチン化アッセイ系の構築を試みた。まず小麦胚芽抽出物を用いた実験系によって、活性型のPUB4の精製が確認された。次に、各種リコンビナント精製タンパク質を用いた実験系を構築するにあたり、PUBに適したE2酵素を探索し、2つの市販のリコンビナントE2を決定した。また、リン酸化部位変異型PUB4タンパク質調製の為の発現ベクターを構築した。
事前の検討からPUB4のユビキチン化ターゲット候補として、CERK1およびPUB4 interacting protein1(PIP1)が挙げられた。そこで、このPIP1とホモログの三重変異体を用い、キチン応答解析を行った結果、PUB4変異体と同様の表現型を示した。このことはPIP1がPUB4の直下で機能することを強く示唆している。この結果を踏まえ、PUB4とPIP1/2/3の重複変異体を得るために、掛け合わせを行い、スクリーニングを進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究実施計画に基づき研究を進め、おおむね期待どおりの結果を得ている。
これまでのPUB4変異体の機能評価では変異体におけるサリチル酸の蓄積が影響をしている可能性が示唆されていたが、本年度、このサリチル酸の蓄積を明らかとし、次年度の解析に必要となる重複変異体を得ることができた。
これまでの研究で、クルードなユビキチン化アッセイ系を用いた時にPUB4がCERK1からリン酸化を受け活性が制御されると示唆されてきた。これを明確に示すにはリコンビナント精製タンパク質を用いたin vitroユビキチン化アッセイ系が必須であり、本年度の研究でこの実験系が構築できたことから、CERK1によるリン酸化の機能評価が加速することが期待される。
PUB4は何かしらの因子をユビキチン化し、シグナル伝達を制御すると考えられる。先行研究において、PUB4と相互作用する分子が得られていたが、本年度はこの因子の変異体を用いた解析からこの因子がPUB4直下で機能することが強く示唆する結果を得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の実施計画に基づき研究を遂行する。
まず、PUB4のキチンシグナル伝達における機能の明確化に関しては、作出しているSA代謝系変異体とPUB4の重複変異体を用い、内在性サリチル酸の定量および、防御応答評価を行うことでPUB4の機能を確定させる。
先行研究で得られているPUB4の相互作用因子に関しては、まず相補個体を得て機能を明確にする。さらにPUB4との重複変異体を得て、シグナル伝達の関係性を遺伝学的手法により明らかとする。この他にもPUB4のユビキチン化ターゲットが存在する可能性も考慮し、Y2Hなどのスクリーニングを進める。さらに、FLAGタグ付きユビキチンを発現する形質転換体を野生型およびPUB4変異体背景に作出し、ユビキチン化タンパク質の免疫沈降、質量分析によって標的因子の探索を進める。in vitroユビキチン化アッセイが構築できたことから、まずはCERK1とPUB4相互作用因子を用いて、これらがPUB4によるユビキチン化修飾を受けるのかについて解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ全ての予算を執行したが、年度末および年度初めに必要となる試薬・消耗品が想定されたため、その購入予算として一部の執行を遅らせたため。
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