| 研究課題/領域番号 |
17K15323
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
長澤 貴宏 九州大学, 農学研究院, 助教 (70775444)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | C5a / 補体 / アナフィラトキシン / ゼブラフィッシュ / 自然免疫 |
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| 研究実績の概要 |
H30年度は作製した研究ツールのin vitroでの活性評価とゲノム編集による欠損系統の確立を中心に研究を進めた。H29年度に作製した抗ゼブラフィッシュC5a抗体（anti-zfC5a Ab）がzfC5aの活性を抑制できるか検証するため、ゼブラフィッシュ腎臓由来白血球を用いた遊走試験を行ったところ、ザイモサン活性化血清に対し遊走する白血球数がanti-zfC5a Ab投与によって顕著に減少したことから、anti-zfC5a AbのzfC5a活性阻害能が示され、またzfC5aがゼブラフィッシュ血漿中における主要な遊走因子であることが示唆された。一方で溶血活性を指標とした活性化前のzfC5に対する活性化阻害試験では、わずかに阻害がみられたものの遊走活性に比べ抑制率が低く、anti-zfC5a Abは活性化前のzfC5よりも活性化により産生されたzfC5aに対し優先的に阻害活性を発揮することが示された。CRISPR/Cas9法による欠損系統作製では、ターゲット遺伝子であるzfC5a受容体（zfC5aR）またzfC5aR様遺伝子（zfC5aR-like）に対するガイドRNAを作製し、これを顕微注入したゼブラフィッシュ胚への変異導入をHMA法により確認したところ、変異遺伝子を有したモザイク欠損魚が得られたため、現在これらを継代しホモ欠損系統の確立と各種試験に必要な数の欠損魚の確保を目指している。さらにAeromonas hydrophilaを用いた感染試験の条件検討も並行して行っており、anti-zfC5a Abを投与した抑制魚及びzfC5aR欠損魚に対しそれらの感染試験を行い、zfC5aの生体防御、炎症への寄与を検証する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までに組換えzfC5a、anti-zfC5a Abの作製を予定通り完了させ、またzfC5aR及びzfC5aR-likeの欠損系統魚の作製も順調に進めている。H31年度にこれらの系統魚由来のzfC5aR欠損白血球を用いたzfC5aに対する遊走能の測定、zfC5a刺激時の遺伝子発現応答、活性酸素産生能を評価し、またこの欠損系統魚、抗体投与によるzfC5a抑制魚を用いた感染試験を行うことで、当初の目的であるzfC5aの魚類生体防御に対する寄与を評価し、zfC5a活性抑制時の炎症反応にどう影響するかを明らかにできると期待される。現在までの研究結果からzfC5aはゼブラフィッシュ生体内で感染局所に白血球を動員する主要な誘引因子として機能していると示唆されており、本研究で作製したzfC5a抑制魚、zfC5aR欠損魚は特に好中球を中心とした自然免疫研究のモデルとして広く活用できると期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
In vivoの試験として、作製したanti-zfC5a Abをゼブラフィッシュ生体に投与し、C5aの活性を抑制した条件下で感染試験、また抗原を顕微注入し局所への生体内白血球遊走試験を行い、zfC5aの感染応答への寄与を調べる。またzfC5aR及びzfC5aR-like欠損魚のからそれぞれ白血球を回収し、これら2種の受容体のどちらがzfC5aの認識に関与するか、あるいはその活性化シグナルにどのような差異があるかをin vitroで検証する。具体的にはzfC5aへの遊走活性、zfC5a刺激による遺伝子発現の変動と活性酸素産生能、貪食活性、殺菌能などを指標とする。またこれらの欠損系統魚に対してはin vivoの試験として同様に感染試験を行い、それぞれの受容体の生体防御への寄与を明らかとする。このときの各種免疫組織での遺伝子発現応答をRNAseqまたはマイクロアレイで解析し、zfC5aの影響による炎症関連遺伝子の発現変動を検出、zfC5aの炎症誘導メカニズムの全容解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
作製した欠損系統の遺伝子発現プロファイル解析に要する費用と、学会発表に要する費用及び論文投稿用の費用として次年度使用額を生じさせた。
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