| 研究課題/領域番号 |
17K15395
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
布目 三夫 名古屋大学, 生命農学研究科, 研究員 (40609715)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | DNA抽出 / フェノール・クロロフォルム法 / ロングPCR / ミトコンドリアゲノム |
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| 研究実績の概要 |
H29年度に実施予定だったものは、以下の2点でした。
①結血液・液浸組織からのDNA抽出・精製：使用するDNAサンプルの多くは、先行研究で既に抽出済みである。新規にDNAを抽出する必要があるサンプルについては、フェノール・クロロフォルム法によりDNAを抽出する。
②ミトコンドリア（mtDNA）ゲノム配列の解読と分子系統学的解析：mtDNAゲノムを精製するため、PCRによるmtDNAゲノムの増幅を行う。ウズラのミトコンドリア全ゲノム（全長およそ16 kbp）を、両端が重なり合う10 kbp程度の二つの領域にわけ、ロングPCRによるミトコンドリアゲノムの増幅・精製を行う。解析対象は、家禽ウズラ18集団 各10個体、合計182個体とする。これまでに、10集団 各10個体から採取した全血サンプルを用いて、ゲノムDNAの抽出を行いました。ゲノムDNAの質は、アガロースゲル電気泳動によって、高分子のゲノムDNAが得られていることを確認しました。ロングPCRによるミトコンドリアゲノム配列の増幅もできており、PCRに利用するプライマーも作成できています。しかし、当初ゲノムDNAの抽出実験で、高分子のゲノムDNAが採れない、採れても短期間で分解され、断片化してしまう、といったトラブルがあったため、予定よりも進行が遅れています。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初めの半年ほど、ミトコンドリアゲノム 10 kbpのロングPCRが成功しない、という問題が生じました。プライマーを数ペア設計し、PCRを試みましたが、増幅しませんでした。
しかし、数年前に別の実験で飼養したウズラのゲノムDNAを用いたロングPCRでは、アガロースゲル電気泳動で10 kbpのバンドが確認でき、プライマーやPCRポリメラーゼが原因ではないことがわかりました。本実験で用いたゲノムDNAを、再度、アガロースゲル電気泳動で確認したところ、DNAの分解が起きていたことがわかり、DNAの断片化がロングPCR失敗の原因であることがわかりました。ゲノムDNAの抽出初期のバッファー（Lysis Buffer）と、抽出後のDNAの溶解に用いた溶解液（Tris-EDTA）を新たに作成しなおしたところ、高分子のゲノムDNAを長期間保存できるようになりました。
改めて抽出したゲノムDNAでは、ロングPCRが成功しています。
よって、ゲノムDNAの抽出を再度行っています。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、10集団10個体ずつから、高品質なゲノムDNAの抽出が完了しています。
5月～6月にかけて、残りの8集団についてゲノムDNAの抽出と、ロングPCRによるミトコンドリアゲノムの増幅を行い、Miseqによる配列解読を行う予定です。
また、ゲノムDNAの抽出が完了し次第、182個体についてRAD-seqによるゲノムワイド多型を用いた集団遺伝学的解析を依頼し、本年度の末ころには、代表個体の選抜とリシーケンスの依頼をだす予定です。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ゲノムDNAの抽出が遅れたため、ミトコンドリアゲノム解析の依頼と、解析用のソフトウェアの購入を行いませんでした。そのため使用額が予定した金額よりも少なくなっています。
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