| 研究課題/領域番号 |
17K15408
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
西村 明 東北大学, 医学系研究科, 助教 (30781728)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | システインパースルフィド / 活性イオウ分子 / 出芽酵母 / システニルtRNA合成酵素 |
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| 研究実績の概要 |
システインにイオウが過剰に結合したシステインパースルフィド（CysSSH）は高い求核性・還元性を有しており、生命活動に極めて重要だと考えられている。これまでに我々は、CysSSHが翻訳関連酵素cysteinyl－tRNA synthetase (CARS)によってシステインから生合成されることを見出している。本研究では、出芽酵母をモデル生物として活用することで、CysSSHの生理機能の解明を目指した。
平成２９年度では、先ずゲノム情報から酵母CARS遺伝子の同定を試みたところ、酵母CARS遺伝子（CRS1）は他の生物種で認められるようなサイトゾル型やミトコンドリア型の区別がないことが示唆された。GFP-tagによる細胞内局在解析においても、CRS1翻訳産物はサイトゾルとミトコンドリアに両局在していることが確認された。両局在化のメカニズムを解析した結果、CRS1は複数の転写開始点を持つことで、1つの遺伝子から2つのタンパク質（サイトゾル型とミトコンドリア型）を発現していることを見出した。次に、CysSSH合成活性に必要なピリドキサルリン酸結合部位に変異を導入し、CysSSH量が減少した株（一倍体）の作製に成功した。この株は野生株に比べて経時寿命の大幅な低下が認められ、減少した寿命が活性硫黄ドナーや硫化水素ドナーでほぼ完全に回復することを発見した。以上より、出芽酵母もCARSによるCysSSH合成経路が保存されていることが明らかとなった。また、CysSSH合成経路が真菌類である酵母細胞にとって極めて重要なシステムであることから、この経路の阻害剤は抗真菌剤の候補になると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、当初計画していた酵母CARS遺伝子（CRS1）の局在および転写機構の解析を行い、CRS1はミトコンドリア形成に関与するHap複合体転写因子依存的に転写開始点を調節することで、一つの遺伝子からサイトゾル型とミトコンドリア型を発現していることを発見した。また、大腸菌から調製した組換えCrs1がCysSSH合成活性を有していることも確認できた。さらに、CysSSH合成活性に必要なピリドキサルリン酸結合部位に変異を導入し、CysSSH量が減少した株の作製に成功した。この株は野生株に比べて経時寿命の大幅な低下が認められ、減少した寿命が活性硫黄のドナーで回復することを発見した。このように、研究目的である酵母CARSの局在化機構を解明した、また、CysSSH機能解析のための変異株の作製に成功し、この株を用いてCysSSHが寿命の制御因子であることを発見した。以上より、研究は計画通り進んでおり、おおむね順調に研究が進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は今年度作製した変異株を用いて、CysSSHの寿命制御機構を詳細に解析する予定である。先ずは、寿命過程における経時的な細胞内CysSSH量やポリスルフィドタンパク質の変動を解析する。さらに、これまでの文献で寿命に関与すると知られているERストレスおよび、タンパク質酸化障害、マイトファジーに注目し解析を進め、CysSSHの寿命制御機構を解明する。また、CysSSHの制御機構の生物種普遍性を明確にするために、線虫を用いた実験も行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、実験に使用する試薬、消耗品などの物品費が当初の予定よりも少ない額で目的を達成することができたため。
ERストレスおよび、タンパク質酸化障害、マイトファジーの検出のために、質量分析用消耗品および、蛍光プローブ、各種抗体の購入に使用する。また、研究成果を論文にまとめ投稿するための英文校正、論文投稿費用として使用する。
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