| 研究課題/領域番号 |
17K15413
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
城所 聡 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (70588368)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 植物 / 低温ストレス / 転写制御 / カルシウムシグナル |
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| 研究実績の概要 |
急速な温度低下による低温時のDREB1の発現誘導を制御する転写因子CAMTA3およびCAMTA5の相互作用因子を探索するため、35S:CAMTA3-sGFPおよび35S:CAMTA5-sGFPの形質転換シロイヌナズナを作出した。この植物体を用いてco-IPをおこない、LC-MS/MS装置によって共精製されたタンパク質を同定した。その結果、すべてのサンプルでCAMTA3、CAMTA5、CAMTA6が検出された。また、カルモジュリンのホモログであるCML12/TCH3が検出された。さらに、その他の相互作用因子候補として、SKIP/SNW domainを持つクロマチンタンパク質であるSKIPと14-3-3タンパク質の１つであるGRF3もすべてのサンプルで検出された。そこで、LC-MS/MSで検出されたCAMTA5、CML12、GRF3、SKIPとCAMTA5の全長との物理的相互作用を酵母two-hybrid法で解析した結果、全ての因子で相互作用が確認された。また、CAMTA5の部分断片を使った酵母two-hybrid法によって、CML12がCAMTA5内のIQ モチーフおよびCaMBドメインを含む領域に相互作用することが示唆された。
IQ モチーフまたはCaMBドメインを欠損/変異させたCAMTA3を過剰発現するコンストラクトを作製し、camta3/5二重変異体に導入した。
シロイヌナズナ植物体にCa2+チャネル阻害剤であるRuthenium Red存在下で2°C/minの低温処理をするとDREB1Bの誘導が弱くなった。一方で、DREB1Aの誘導には変化は見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２９年度の研究計画のうち、CAMTAの活性制御に関わるカルシウムシグナルの同定については、CAMTAの活性阻害に関わると考えられるカルシウムチャネル阻害剤を同定できた。CAMTAの修飾酵素や相互作用因子の同定については、複数の因子でCAMTA5との酵母内での相互作用を確認できた。以上のことから、研究計画は順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
CAMTA2/3/5と、LC-MS/MSで検出された相互作用因子候補とのシロイヌナズナ植物体内での相互作用を1:1のco-IP、BiFCによって確認する。また、低温処理の有無によって相互作用強度が変化するかを解析する。
CAMTAと相互作用因子候補の相互作用領域を同定し、その領域を変異させたCAMTA5発現するコンストラクトを作製し、camta変異体に導入する。
IQ モチーフまたはCaMBドメインを欠損/変異させたCAMTA3を発現する形質転換シロイヌナズナに低温処理をおこないDREB1AおよびDREB1B遺伝子の発現量を測定する。
シロイヌナズナ植物体に他のCa2+チャネル阻害剤存在下で2°C/minの低温処理をおこないDREB1AおよびDREB1B遺伝子の発現量を測定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
共免疫沈降およびLC-MS/MSによる共精製産物の同定を1回しかおこなわなかったため、執行額は当初の見込み額は異なってしまった。しかし、再現性の確認および別条件での共精製産物の同定を試みることから、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
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