| 研究課題/領域番号 |
17K15413
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
城所 聡 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (70588368)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 植物 / 低温ストレス / 転写制御 / カルシウムシグナル |
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| 研究実績の概要 |
急速な温度低下による低温ストレス時のDREB1遺伝子の発現誘導を制御する転写因子CAMTA3およびCAMTA5の相互作用因子を前年度に引き続き探索した。前年度にCAMTA5のT-DNA挿入変異体内にCAMTA5自身のプロモーターによってGFP-CAMTA5を発現させた相補植物体を作出した。このCAMTA5相補植物体を用いて共免疫沈降をおこない、質量分析装置によって共精製されたタンパク質を同定した。その結果、過剰発現体を用いた結果と同様に、カルシウム結合タンパク質の1つであるカルモジュリン(CaM)とカルモジュリン様タンパク質の一種(CMLa)が検出された。これまでの共免疫沈降・質量分析実験によって同定された相互作用因子について、タバコへの一過的発現系を用いたsplit-Luciferase法によってCAMTA5との相互作用を解析した。その結果、CAMTA同士の二量体形成とCAMTA5-CMLaの相互作用が確認された。酵母two-hybrid法に寄って、CMLa近傍の５種類のCMLとCAMTA5のC-末端(IQモチーフおよびCaMBドメインを含む)との相互作用を確認した。その結果、CAMTA5と相互作用したのはCMLaのみであった。GFPと融合したCMLaを過剰発現する形質転換シロイヌナズナを作出した。この植物体を用いて蛍光観察をおこなった結果、通常生育時および低音ストレス処理時の両方において核と細胞質に蛍光が見られた。CMLaのT-DNA挿入変異体を単離し、この植物体でCMLa遺伝子の発現が失われている事を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
相互作用をさらに確認するための1:1の共免疫沈降実験と、CMLaの発現部位を同定するプロモーター-GUS実験を行う予定であったが、形質転換シロイヌナズナを得ることができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
CMLaプロモーター-GUSを発現する形質転換シロイヌナズナを用いてCMLaの発現部位を同定する。CMLaとCAMTA5の共発現する形質転換シロイヌナズナを用いて、in plantaでのCMLa-CAMTA5の相互作用を確認し、低温ストレスの有無での相互作用量の変化を調べる。CMLaの過剰発現体およびT-DNA挿入変異体を用いてDREB1の発現量を解析する、
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| 次年度使用額が生じた理由 |
これまでにCAMTA転写因子の相互作用因子候補として1種類のカルモジュリン様タンパク質(CML)を得た。令和元年度に相互作用を 確認するための1:1の共免疫沈降実験と、CMLの発現部位を同定するプロモーター-GUS実験を行う予定であったが、実験を行うための形質転換シロイヌナズナを得ることができなかった。そのため、次年度にこれらの植物体を作り直すとともに実験をおこなう。また、単離したCMLのT-DNA挿入変異体を作出する。この変異体を用いてDREB1遺伝子の発現の測定と凍結ストレス耐性試験をおこなうことで、CMLが低温ストレス応答に与える影響を解析する。
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