| 研究課題/領域番号 |
17K15434
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
神庭 圭佑 京都大学, エネルギー理工学研究所, 研究員 (00795049)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 生体分子 / NMR / 相互作用 / APOBEC3G / HIV |
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| 研究実績の概要 |
ヒトAPOBEC3G（A3G）タンパク質は、ウイルスDNAを改変することによりHIVに対する生体防御を担う。一方でHIVのVifタンパク質はA3Gを無力化する。ヒト細胞中では、Vifタンパク質はヒトのE3ユビキチンリガーゼ複合体と複合体（Vif複合体）を形成する。
前年度はVif複合体がA3Gの活性を直接阻害することを示し、これまで報告されていたA3GのN端ドメインのみならず、C端ドメインもVif複合体と相互作用することを見出した。今年度はVif複合体中のどの分子が、何と相互作用しているのか詳細な検証を行った。ゲルシフトアッセイ、蛍光異方性、サイズ排斥クロマトグラフィー、分析用超遠心、NMR法で解析した結果から、VifはDNAと強く相互作用する一方、Vif複合体に含まれるヒト由来のタンパク質がA3Gと弱いながらも相互作用することが明らかになった。更に、Vif単独の調製に成功し、このVifはDNAと強く相互作用するものの、A3Gの活性を阻害する効果はないことが明らかになった。その結果、Vifタンパク質によるA3G阻害の実態はVifタンパク質中に含まれるヒトタンパク質が担っていることが示唆された。
また、Vif複合体の標識では、昨年度達成した、複合体の各蛋白質の選択的13C、15N標識に加え、各タンパク質中のプロトンを重水に置換することも可能となった。超遠心解析の結果、Vif複合体は低濃度では主として単量体として溶液中に存在するものの、NMR濃度では凝集しやすい傾向があることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初想定していなかった、Vif複合体中のヒトタンパク質とA3Gとの相互作用が示唆され、その検証のため、計画の変更を余儀なくされたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
Vif複合体によるA3G阻害効果をVif以外のタンパク質が担うか検証するため、Vifの変異体を作成し、Vifによる影響を検討する。溶媒条件等を検討することで、Vif複合体が多量体を形成しにくい条件を模索し、複合体中のVif分子のみを標識したNMRスペクトルを測定する。また、共同研究の結果、Vifと結合するRNAアプタマーを同定することができた。このRNAアプタマーがVif複合体によるA3G阻害を無力化、即ち抗HIV薬のシーズとなり得るか検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初検討していなかった、Vif複合体中のヒトタンパク質とA3Gの相互作用が示唆され、その検証のために計画を変更する必要が生じた。今年度はVifの変異体の調製も行い、VifによるA3G阻害のメカニズムについて、論文にまとめる。また、共同研究者がVifと相互作用するRNAアプタマーを取得したため、申請者が作成した評価系を用いて、このRNAアプタマーがVifの阻害剤、すなわち新規抗HIV薬のシーズになり得るか検証する。
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