| 研究課題/領域番号 |
17K15439
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
山本 佐知雄 近畿大学, 薬学部, 講師 (10707954)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | マイクロフルイディック / オンライン濃縮 / オンライン蛍光標識 / マイクロチップ |
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| 研究実績の概要 |
高機能化マイクロチップを用いるバイオ医薬品の超高速分析システムの開発ではバイオ医薬品の研究や品質管理に使用するため濃縮、特異的抽出および粗分画、蛍光検出などの一連の過程をチップ上で30分以内に完了することが可能な高速分析法の開発を目指している。平成30年度は細胞培養や輸送に適したフォトリソグラフィーフリー多分岐流路を有するマイクロチップの作製およびタンパク質の特異的オンライン濃縮への応用と、このタンパク質オンライン濃縮型マイクロチップと，捻じれ型流路を用いた糖鎖の蛍光標識化に関する研究を行った。作製したフォトリソグラフィーフリーのマイクロチップを用いて、8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate（APTS）標識化イソマルトオリゴ糖の電気泳動分離を試みた。その結果15本以上のピークを検出することができ、作製したマイクロチップでも十分に分離・検出が行えることが分かった。続いて6-8 kDの半透膜を用いた3次元マイクロチップを用い、分子量が80 kDのヒト血清トランスフェリンのオンライン濃縮を試みたところ、時間経過とともに流路交差部の蛍光強度の増大が確認できた。また、導入時間240秒における濃縮効率を算出した結果、透析膜を配置しなかった場合と比べ、感度が約70倍向上した。本法により作製したサイズ排除型3次元マイクロチップにおいて、濃縮を達成しつつ過剰試薬の除去が達成されたことが分かった。また、このチップを作製する上で使用した流路をねじった状態でPDMS内に設置することで糖鎖のAPTS標識化反応に適したマイクロチップを作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度は細胞培養や輸送に適したフォトリソグラフィーフリー多分岐流路を有するマイクロチップの作製およびタンパク質の特異的オンライン濃縮への応用と、このタンパク質オンライン濃縮型マイクロチップと，捻じれ型流路を用いた糖鎖の蛍光標識化に関する研究を行った。フォトリソグラフィーフリー多分岐流路の作製は様々な最適化を行い、2つの独立した流路の間に透析膜を設置したマイクロチップを再現良く作製することが可能となった。また、封入している透析膜の分子量排除の大きさに応じたタンパク質の特異的濃縮が可能となっている。現在は透析膜の代わりに市販のナノフィルターを配置し、この上で細胞が留まるか検討を行っている。捻じれ型マイクロ流路の作製に関しては圧力による送液のみでAPTS標識化糖鎖を得ることが可能となった。現在標識化反応の反応条件の最適化と上記タンパク質捕捉型マイクロチップとの統合に向けて研究を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成31年度は昨年度の研究結果をまとめつつ以下に示す実験を行う予定である。
多分岐流路を有するマイクロチップを用い，異なる機能をもつ複数のゲル層を流路上に配し，濃縮，反応，粗分画，特異的抽出の一連の過程を実現する。：申請者らは，マイクロチップに光重合性アクリルアミドゲル層をピンポイントで合成する化学的な技術を導入し，その可能性を検討してきた．また、抗体医薬品中の糖鎖含量を詳細に調査するなどの実績もある．そこで培養細胞や抗体医薬品の糖鎖の抽出・濃縮・分離・検出といった一連の分析操作を1 枚のチップの上で30 分以内に完結することが可能な糖鎖分析用マイクロチップ電気泳動法の開発を行う．これまでの研究において、ゲルを用いた抽出、オンライン濃縮を達成し、本実験計画中で達成した酵素消化サイズ分画などの個別の前処理を流路内で達成してきたため、これら前処理技術を一度に達成するために三次元構造のマイクロチップを作製し、電圧印加のみで糖鎖解析を実施する方法を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
例年、参加実績のない学会などからも含め招待講演が3件あったため、研究計画以上に旅費を計上する結果となってしまった。このためこの年に購入予定であった用品の購入を次年度に回すこととなったためこの購入費に充てる。
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