ジアシルグリセロールキナーゼαが癌細胞増殖を促す一方でT細胞を不活化する分子機構

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K15444
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 高橋 大輔 九州大学, 薬学研究院, 助教 (70791523)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: ジアシルグリセロールキナーゼ / DGK / 脂質キナーゼ / 立体構造解析 / EFハンドモチーフ / 昆虫細胞・バキュロウイルス / がん免疫

研究実績の概要

細胞内シグナリングの分岐器として機能する脂質キナーゼDGKαの分子基盤を解明することを目的として研究を行った．
触媒ドメインの構造解析：前年度にDGKα全長の試料の発現系を昆虫細胞を用いて確立した．本年度はDGKα全長の試料の大量発現と精製を進めた．精製試料の活性の確認，二次構造解析を行った後（Takahashi et al., Peer J, 2018），結晶化スクリニーングを進めたが，蛋白質結晶は得られなかった．さらに今後の結晶化のための試料調製の効率を上げるため，新規のコンストラクトを作成した．
EF-handドメインの構造解析： 前年度に着手したEF-handの結晶構造解析とCa2+結合による構造変化の解析を継続し，Ca2+結合型のDGKα EFの結晶構造を2.1Aの分解能で決定した．DGKα EFは，EF-handのリガンド様ヘリックス(LM helix)をもち，LM helixが疎水的相互作用を介してDGKα EFにパッキングされていることが明らかになり，Ca2+を介したDGKαの分子内活性制御に関与している可能性が示唆された（Takahashi et al., Protein Sci, 2019）．

２年間の研究を通して，これまで理解が乏しかったDGKの構造生物学的研究を進めた．昆虫細胞を用いて活性を保持したDGKα全長の試料を初めて大量発現させ，結晶化のための高純度に精製した試料を得た．さらにN末端の活性制御領域であるDGKα EFのCa2+結合型の結晶構造を決定するとともに，Ca2+が結合するとDGKα EFがプロテアーゼ耐性のあるリジッドな構造へと変化することを生化学・物理化学的手法により明らかにした．本研究によるDGKα試料調製法の確立と，N末端領域に関する構造生物学的理解は，がん免疫治療の標的の一つとして注視されているDGKαの阻害剤開発へ貢献し得る．

研究成果

• [雑誌論文] Crystal structure and calcium-induced conformational changes of diacylglycerol kinase alpha EF-hand domains. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, D., Suzuki, K., Sakamoto, T., Iwamoto, T., Murata, T., and Sakane, F.
  • 雑誌名: Protein Scienece 巻: 28 ページ: 694-706
  • DOI: 10.1002/pro.3572
  • 査読あり
• [雑誌論文] Myristic acid specifically stabilizes diacylglycerol kinase delta protein in C2C12 skeletal muscle cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Iwata, K., Sakai, H., Takahashi, D. and Sakane F.
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta - Mol Cell Biol Lipids 巻: In press ページ: In press
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2019.04.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression, purification and characterization of human diacylglycerol kinase zeta (2019)
  • 著者名/発表者名: Saito, T., Takahashi, D. and Sakane, F.
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 4 ページ: 5540-5546
  • DOI: 10.1021/acsomega.9b00079
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Diacylglycerol kinase alpha-selective inhibitors induce apoptosisツ?and reduce viability of melanoma and several other cancer cell lines. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamaki, A., Akiyama, R., Murakami, C., Takao, S., Murakami, Y., Mizuno, S., Takahashi, D., Kado, S., Taketomi, A., Shirai, Y., Goto, K. and Sakane, F.
  • 雑誌名: Journal of Cellular Biochemistry 巻: 120 ページ: 10043-10056
  • DOI: 10.1002/jcb.28288
  • 査読あり
• [雑誌論文] Diacylglycerol kinase beta induces filopodium formation via its C1, catalytic and carboxy-terminal domains and interacts with the Rac1-GTPase-activating protein, ホイ2-chimaerin. (2018)
  • 著者名/発表者名: Maeda, Y., Shibata, K., Akiyama, R., Murakami, Y., Takao, S., Murakami, C., Takahashi, D., Sakai, H., and Sakane, F.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 504 ページ: 54-60
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.08.119
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression and purification of human diacylglycerol kinase alpha from baculovirus-infected insect cells for structural studies. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, D. and Sakane, F.
  • 雑誌名: Peer J 巻: 6 ページ: e5449
  • DOI: 10.7717/peerj.5449
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Abnormalities of the serotonergic system in diacylglycerol kinase delta-deficient mouse brain. (2018)
  • 著者名/発表者名: Lu, Q., Komenoi, S., Usuki, T., Takahashi, D., and Sakane, F.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 497 ページ: 1031-;1037
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.02.165
  • 査読あり
• [学会発表] DGKalpha活性制御の分子基盤：N末端RVH領域へのCa2+結合の物理化学的解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋大輔，嶋田睦，Jose Caaveiro, 阿部義人，植田正，坂根郁夫
  • 学会等名: 日本生化学会九州支部例会
• [学会発表] α-シヌクレインの脂質結合能の解析とPAプロー ブへの応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山田遥夢, 高橋大輔, 坂根郁夫
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] バキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いたジアシルグリセロールキナーゼζの発現精製と酵素学的解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 西藤巧, 高橋大輔, 坂根郁夫
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会
• [学会発表] Abnormalities of the serotonergic system in diacylglycerol kinase δ-deficient mouse brains. (2018)
  • 著者名/発表者名: Lu, Q., Komenoi, S., Takahashi, D. and Sakane, F.
  • 学会等名: 59th International Conference on the Bioscience of Lipids "Lipid Fluxes and Metabolism; From Fundamental Mechanisms to Human Disease":
  • 国際学会
• [学会発表] Molecular basis for the intramolecular regulation of DGKα: analysis of Ca2+ induced conformational changes in N-terminal EF-hand motifs (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, D., Suzuki, K., Sakamoto, T., Iwamoto, T., Murata, T., and Sakane, F.
  • 学会等名: 第18回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] ジアシルグリセロールキナーゼδの欠損はセロトニン神経系の機能低下を惹起する (2018)
  • 著者名/発表者名: 陸強, 米野井優, 高橋大輔, 坂根郁夫
  • 学会等名: 第60回日本脂質生化学会
• [備考] 千葉大学大学院 理学研究院 化学研究部門 生体機能化学研究室HP
  • URL: https://sakane32.wixsite.com/biofunctionchemistry
• [備考] 九州大学大学院 薬学研究院 蛋白質創薬学分野HP
  • URL: http://meneki.phar.kyushu-u.ac.jp/Protein/TOP.html