三分割GFPを基盤とした免疫化学的蛍光センサーの開発

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K15466
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 坂元 政一 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (50610177)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 蛍光センサー / ハリントニン

研究実績の概要

本研究課題では、抗原認識能を有する可変領域の重鎖(VH)と軽鎖(VL)断片間の抗原存在下における相互作用と三分割GFPの概念を融合し、強力な抗白血病活性を 有するハリントニン(HT)の迅速かつ高感度な蛍光免疫化学的センサーの開発を目的としている。 本計画は大きく以下の3項目より構成されている。 (1)VH及びVL断片遺伝子のクローニング及び小型化抗体(scFv)としての機能評価【平成29年度】 (2)VH-GFP10遺伝子、GFP11-VL遺伝子、GFP1-9遺伝子の構築及び発現系の検討【平成30年度】 (3)蛍光センサーの開発【平成31年度】
これまでに、VH-GFP10遺伝子とGFP11-VL遺伝子及びGFP1-9遺伝子を構築し、HTの存在下における傾向検出を目指していた。しかし、四元複合体の形成に伴う蛍光が認められなかった。そこで、GFP10とGFP11の距離を近づけるようVH-GFP10とGFP11-VL 遺伝子を柔軟なペプチドリンカー(GGGGS)n(n=2, 3)で連結したVH-GFP10-GFP11-VL(scFvGs)を構築し、その機能解析を行った結果、scFvGsがHTを特異的に認識することを見出した。本年度は、より機能の優れたscFvG10に絞りこみ、HTの存在下で蛍光検出が可能か精査した。大腸菌発現系を用いたscFvG10の巻き戻しを行い、同様に巻き戻したGFP1-9及びHTを種々の条件で混合した。その結果、コントールと比較した場合僅かな蛍光が検出されたものの、蛍光強度が低く、定量に用いることができなかった。現在、巻き戻しの条件検討、発現系の検討、検出系の条件検討を行い、本課題の完結を目指した研究を遂行している。

研究成果

• [雑誌論文] An estimated quantitative lateral flow immunoassay for determination of artesunate using monoclonal antibody (2020)
  • 著者名/発表者名: Kitisripanya, T., Sermpradit, W., Sakamoto, S., Tanaka, H., Putalun, W.
  • 雑誌名: Biomedical Chromatography 巻: 34 ページ: e4718
  • DOI: doi: 10.1002/bmc.4718.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Development of a simple and rapid method for detection of isomiroestrol in Pueraria candollei by an immunochromatographic strip test (2019)
  • 著者名/発表者名: Chaingam, J., Kitisripanya, T., Krittanai, S., Sakamoto, S., Tanaka, H., Putalun, W.
  • 雑誌名: Journanl of Natural Medicines 巻: 73 ページ: 577-583
  • DOI: doi: 10.1007/s11418-019-01307-6.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Modification of first constant domain of heavy chain (CH1) enabled effective folding of functional anti-forskolin antigen-binding fragment (Fab) for sensitive quantitative analysis (2019)
  • 著者名/発表者名: Yusakul, G., Sakamoto, S., Tanaka, H., Morimoto, S.
  • 雑誌名: Biotechnology Progress 巻: 35 ページ: e2822
  • DOI: doi: 10.1002/btpr.2822
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Preparation of a highly specific single chain variable fragment antibody targeting miroestrol and its application in quality control of Pueraria candollei by enzyme-linked immunosorbent assay (2019)
  • 著者名/発表者名: Pongkitwitoon, B., Boonsnongcheep, P., Kitisripanya, T., Yusakul, G., Sakamoto, S., Tanaka, H., Morimoto, S., Putalun, W.
  • 雑誌名: Phytochemical Analysis 巻: 30 ページ: 600-608
  • DOI: doi: 10.1002/pca.2832
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Preincubation format for a sensitive immunochromatographic assay for monocrotaline, a toxic pyrrolizidine alkaloid (2019)
  • 著者名/発表者名: Yusakul, G., Sakamoto, S., Chanpokapaiboon, K., Tanaka, H., Morimoto, S.
  • 雑誌名: Phytochemical Analysis 巻: 30 ページ: 653-660
  • DOI: doi: 10.1002/pca.2838.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] ピロリチジンアルカロイド、モノクロタリンの高感度免疫化学的測定法の確立 (2020)
  • 著者名/発表者名: 坂元 政一、Gorawit Yusakul、長光 梨花、田中 宏幸、森元 聡
  • 学会等名: 日本薬学会 第140年会