| 研究実績の概要 |
本研究では、精子形成を司る真の精子幹細胞の同定と、その維持や分化に関わる新規遺伝子の同定を目指し、次世代シークエンサー技術を含む網羅的な解析を実施した。まず、成体マウスの精子幹細胞と前駆細胞を精巣から採取するため、マーカータンパク質の発現パターンをもとに幹細胞はGFRa1+/Kit-,Ngn3+/Kit-の2集団、前駆細胞はGFRa1+/Kit+, Ngn3+/Kit+の2集団に分けてセルソーターを用いたシングルセルソートを行い、細胞を採取した。その後、個々の細胞をM&T-seqの手法に従い、同一細胞からRNAとDNAをとりわけ、scRNA-seq, scBS-seqライブラリーを作製した後、次世代シークエンサーにて解析した。その結果、scRNA-seqデータの解析からは、上記の4集団の細胞が分化度に相関して分布し、Plzf, GFRa1, Kit等の既知のマーカー遺伝子が予想通りの発現パターンを示すことが確認されたため、高品質なデータが得られていると考えられた。また、このデータから、精子幹細胞集団にはある程度の多様性が存在し、それぞれの段階において特異的な発現を示す遺伝子が存在することが示された。さらに、幹細胞が分化する際にKit遺伝子が発現し始めるタイミング(エピジェネティック・スイッチ)に近い細胞を捉えることができた。また、scBS-seq解析からは、遺伝子の調節領域においてDNAメチル化が段階的に変化する領域を同定している。今後の解析によりそれらと重要遺伝子の発現の関連性を調べることを予定している。また一方で、組織学的解析とヒストン修飾解析により、精子幹細胞の分化(エピジェネティック・スイッチ)において、ヒストン修飾酵素Kmt2bが必須であることを同定した。
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