| 研究課題/領域番号 |
17K15567
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
粂 慎一郎 大分大学, 医学部, 助教 (90794579)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / hERGチャネル / 構造機能連関 / 分子生物学 / 電気生理学 |
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| 研究実績の概要 |
電位作動性カリウムチャネルであるhERGチャネルの機能不全は、QT延長症候群の原因として知られ、その分子機能の解明は生理学的な役割を研究する上でも重要である。本研究の目的は、hERGチャネルの特徴的な遅い脱活性化について、C末端細胞内ドメインが関与する制御機構を解明することである。我々はこれまでに、C末端細胞内領域に存在する環状ヌクレオチド結合相同ドメイン（CNBHD）と、その上流でチャネルゲートとCNBHDを結ぶCリンカードメイン（CLD）間に2つの静電相互作用が存在し、遅い脱活性化の制御に重要であることを見出してきた。
hERGチャネルは4量体として機能し、CLDとCNBHDも4量体を形成する。しかし、上記の2つのCLD-CNBHD間静電相互作用について、①サブユニット間・内相互作用のどちらか、②正常な機能の維持に必要な静電相互作用の個数はいくつか、また、③チャネルの開・閉状態に依存した構造変化への関与はあるのか等、未だ不明な点が多い。そこで、本研究ではこれらの解析を計画し、当年度は①と②について、サブユニットを連結させたタンデムコンストラクトを使用した実験・解析を行った。
①の解析の結果は、2つの静電相互作用がいずれも同一サブユニット内で形成されることを示した。この構造的特徴は、似たC末端細胞内ドメインをもつ他のイオンチャネルでの報告とは異なっており、遅い脱活性化のためのhERGチャネル独自の制御機構であると考えられる。②の解析では、静電相互作用の個数を制限した際、その個数の減少に依存して脱活性化が加速する結果が得られた。これは、正常な機能の維持には4量体全てに静電相互作用が存在する必要があり、各静電相互作用がサブユニットごとに独立して脱活性化の制御に関与している可能性を示唆する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、hERGチャネルの遅い脱活性化の制御に重要な2つのCLD-CNBHD間静電相互作用について、4量体を形成した際、①サブユニット間・内相互作用のどちらか、②正常な機能の維持に必要な静電相互作用の個数はいくつか、また、③チャネルの開・閉状態に依存した構造変化への関与はあるのかを明らかにするため、その解析を計画している。
このうち当年度は①と②の解析を行う計画であり、これらの計画に基づいた実験により、①2つの静電相互作用はいずれも同一サブユニット内で形成されること、また、②脱活性化の速度は各静電相互作用の個数の減少に依存して加速し、正常な機能の維持には4量体全てに静電相互作用が存在する必要があることが示唆された。①の結果は、以降の実験・解析を計画する際、サブユニットの位置関係を考慮する上で必要な知見である。②の結果は、「研究実績の概要」欄に記載した内容の他にも、CLD-CNBHD間の静電相互作用に異常のあるサブユニットが野生型サブユニットと共発現した際、ヘテロ4量体を形成し脱活性化を加速させるリスクも示唆している。これは、hERGチャネルの生理学的・病理学的な研究への応用が期待できる。
以上のように、いずれの実験も当初の計画通りに年度内で完了したため、本実験計画はおおむね順調に進展していると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は今後、研究実施計画に基づき、2つのCLD-CNBHD間静電相互作用について、チャネルの開・閉状態に依存した構造変化への関与の解析を中心に、CLDとCNBHDの構造変化の解析を予定している。
初めに、平成30年度の研究実施計画に記載したように、細胞質内での直接的な相互作用が考えられる2つのアミノ酸をシステインに置換した二重変異体を作製し、それを細胞膜へ発現させる。もし、これらのアミノ酸が開または閉状態に依存して接近する場合、いずれかの状態下で酸化剤を添加することでジスルフィド結合が形成され、その後の構造変化を阻害する。膜への発現後、酸化剤を添加した際に機能の変化が見られるかどうかを電気生理的に測定することで、構造変化の有無を解析する。
上述の解析が終了した後、さらにN末端細胞内ドメインを含む構造変化の解析も予定している。hERGチャネルのN末端細胞内ドメインはCNBHDと相互作用しており、この相互作用も遅い脱活性化の制御に重要であるという報告がある。我々は現在、2つのCLD-CNBHD間静電相互作用のうち1つが、N末端細胞内ドメイン-CNBHD間相互作用に重要であるという知見を得ている。このCLD-CNBHD間静電相互作用の破壊によるC末端細胞内ドメインの構造変化とN末端細胞内ドメインとの関係を解明することにより、hERGチャネルのより詳細な制御機構の理解が期待できる。
本研究の今後の推進方策としては以上の実験・解析の遂行を目指し、C末端細胞内ドメインが関与するhERGチャネルの遅い脱活性化の制御機構の解明に向けて尽力したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた主な理由として、当年度は所属機関の移動があったため、それに伴う引っ越し等により実験に充てる時間が当初の予定よりも少なくなったことが挙げられる。当年度の実験・解析は当初の計画通り完了したが、上述の理由から、より踏み込んだ研究については移動後に行うようにし、また、発注等に時間のかかることが予想される物品等の購入も、ある程度控えるように配慮した。このような事から、次年度使用額が生じる結果となった。
翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画としては、翌年度の研究実施計画に基づいた実験・解析に伴う物品等の購入や、翌年度のその他の使用計画に従った使用に加え、移動前に控えていた物品等の購入にも使用する予定である。
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