複数のマイクロRNA産生制御を介した新規癌治療法の開発を目指した基礎研究

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K15601
• 研究機関: 高知大学
• 研究代表者: 樋口 琢磨 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (10754567)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: microRNA / RNA結合タンパク質 / NF90 / NF45

研究実績の概要

二本鎖RNA結合タンパク質NF90とその結合パートナーであるNF45の複合体（NF90-NF45）はmiRNAの初期転写産物 (primary-miRNA: pri-miRNA)に結合し、その生合成経路を負に制御する。NF90-NF45は複数種のpri-miRNAに結合するが、その結合能には選択性があり、特に癌抑制能を有するpri-miRNAに強く結合することが報告されている。しかしながら、NF90-NF45がpri-RNAのどのような配列・構造を認識しているのかは未だ不明な点が多い。本研究ではNF90-NF45が強く結合する配列的・構造的特徴を同定するとともに、同定された特徴を持つデコイRNAによるNF90-NF45のRNA結合能阻害試薬の開発を目的としている。
今回、国際共同研究により、NF90-NF45がmiR-3173の初期転写産物(pri-miR-3173)への結合を介してmiRNA産生制御因子Dicerの発現を調節することで、卵巣癌の進展に関与することを新たに見出した (Barbier et al., Cell Research, 2018)。
この結果を受け、これまでにNF90-NF45との結合が確認されているpri-miRNAの中で、癌抑制miRNAである let-7a、miR-7と癌促進的miRNAであるmiR-21に加え、新たに見出したmiR-3173に対するNF90-NF45の結合能をRNAゲルシフトアッセイで比較検討した。その結果、pri-let-7a > pri-miR-7 > pri-miR-3173 > pri-miR-21の順でNF90-NF45との結合能が強いことが明らかとなった。現在、上記pri-miRNA間の配列・構造の違いを解析すると共に、RIP-sequenceによるNF90-NF45と結合するRNAの網羅的解析の準備を進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当初の計画では、2017年度にTARGET-tag融合NF90-NF45複合体を過剰発現させた培養細胞から免疫沈降法によりNF90-NF45複合体と結合するRNAを精製し、次世代シーケンサーを用いてNF90-NF45に結合するRNAの配列的・構造的特徴を網羅的に解析する予定であった。しかしながら国際共同研究を通して、卵巣癌の進展に関与するmiR-3173の生合成にNF90-NF45が関与する可能性が得られたため、先んじてNF90-NF45とpri-miR-3173の結合能の検証を実施した。その結果、NF90-NF45がpri-miR-3173に結合し、miR-3173の生合成を負に制御することを新たに見出した。一方で、NF90-NF45が結合するRNAの網羅的解析の実施に至らなかったため次年度(2018年度)に行う。

今後の研究の推進方策

2018年度は、TARGET-tag融合NF90-NF45複合体を過剰発現させた培養細胞からNF90-NF45に結合するRNAを免疫沈降法で精製し、その配列を次世代シーケンサーにより網羅的に解析するRIP-sequenceを実施する。得られたNF90-NF45に結合するRNAのデータをもとに、共通する配列・構造を解析する。また2017年に、ChIP SeqやRNA Seqの結果を公開しているデータベース「ENCODE」にNF90と結合するRNAを解析したデータが追加された。このデータを実施予定の RIP-sequence の網羅的解析結果と合わせて、NF90-NF45が結合するRNAの配列的・構造的特徴を探索する。
さらに2017年度の解析結果より、pri-miR-3173とNF90-NF45が中程度の強さで結合する事を踏まえ、強く結合する pri-let-7a-1、pri-miR-7-1、結合性が非常に弱い pri-miR-21のRNA二次構造を比較し、NF90-NF45が結合するRNA構造を同定する。
NF90-NF45が結合する RNAの配列的・構造的特徴の候補が得られた場合、候補の特徴を有したRNAオリゴ(デコイRNA)を合成し、既知のpri-miRNAよりもNF90-NF45と強く結合するかをゲルシフトアッセイにより検証する。また、デコイRNAを培養細胞に導入することで、NF90-NF45が生合成制御に関与する癌抑制型miRNAの産生への影響をqRT－PCR法により検証する。
上記の解析を通して、デコイRNAによるNF90-NF45の機能阻害を介した 癌抑制miRNAの産生促進系の構築を試みる。

研究成果

• [国際共同研究] CNRS, University of Montpellier(フランス)
  • 国名: フランス
  • 外国機関名: CNRS, University of Montpellier
• [国際共同研究] Sun Yat-sen University Cancer Center(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Sun Yat-sen University Cancer Center
• [雑誌論文] An NF90/NF110-mediated feedback amplification loop regulates dicer expression and controls ovarian carcinoma progression (2018)
  • 著者名/発表者名: Jerome Barbier, Xin Chen, Gabriel Sanchez, Muyan Cai, Marion Helsmoortel, Takuma Higuchi, Pierre Giraud, Xavier Contreras, Gangjun Yuan, Zihao Feng, Rima Nait-Saidi, Olivier Deas, Lisa Bluy, Jean-Gabriel Judde, Sylvie Rouquier, William Ritchie, Shuji Sakamoto, Dan Xie, Rosemary Kiernan
  • 雑誌名: Cell Research 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1038/s41422-018-0016-8.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 二本鎖 RNA 結合タンパク質によるケモカイン CXCL5 の発現制御を介した癌細胞の浸潤能制御機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 樋口琢磨、三輪武司、森澤啓子、Sylvia Lai、坂本修士
  • 学会等名: 第58回日本生化学会中国・四国地区支部例会
• [学会発表] 夏期の柚子果皮給与が褐毛和種高知系の肥育に与える影響ーオミクス解析による検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 薮本美月、岩本侑希子、樋口琢磨、坂本修士、森澤啓子、岩佐茜、久保里加、宅谷はるこ、竹中由布、竹村泰雄、垣渕和正、石田豊、松川和嗣
  • 学会等名: 日本畜産学会 第123回大会
• [学会発表] 凍結乾燥によるマウス胚性線維芽細胞の保存 (2017)
  • 著者名/発表者名: 宮野友里、本郷新、田村慎之介、樋口琢磨、坂本修士、枝重圭祐、松川和嗣
  • 学会等名: Cryopreservation Conference 2017
• [学会発表] NASH モデルマウスの肝細胞において Nuclear Factor 90 の発現は増加する (2017)
  • 著者名/発表者名: 樋口琢磨、宗景玄祐、矢生健一、Sylvia Lai、松川和嗣、津田雅之、小野正文、坂本修士
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会(第40回日本分子生物学会年会・第90回日本生化学会大会)
• [学会発表] 骨格筋において過剰発現した NF90-NF45は赤筋化を誘導する (2017)
  • 著者名/発表者名: 坂本修士、森澤啓子、Sylvia Lai、樋口琢磨、戸高寛、池恩燮、杉山康憲、津田雅之
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会(第40回日本分子生物学会年会・第90回日本生化学会大会)
• [学会発表] RNA 結合タンパク質を介した新たな膵β細胞増殖機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: Sylvia Lai、樋口琢磨、津田雅之、森澤啓子、杉山康憲、坂本修士
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会(第40回日本分子生物学会年会・第90回日本生化学会大会)
• [学会発表] 膵臓β細胞におけるコレステロール増加はインスリン発現を抑制する (2017)
  • 著者名/発表者名: 藤井修作、飯田悟史、戸高寛、樋口琢磨、坂本修士、村尾孝児、杉山康憲
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会(第40回日本分子生物学会年会・第90回日本生化学会大会)
• [学会発表] 糖毒性状態の膵臓β細胞において Dclk1はインスリンの発現を抑制する (2017)
  • 著者名/発表者名: 井戸彩詠、樋口琢磨、戸高寛、坂本修士、村尾孝児、杉山康憲
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会(第40回日本分子生物学会年会・第90回日本生化学会大会)
• [備考] 高知大学 総合研究センター 生命・機能物質部門 生体機能解析分野 分子生物学教室 ホームページ
  • URL: http://www.kochi-ms.ac.jp/~ct_mrc/academic/