| 研究課題/領域番号 |
17K15606
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
下中 翔太郎 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 博士研究員 (90778747)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | Alzheimer病 / Tau / PICALM / 異常凝集 / 伝播 |
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| 研究実績の概要 |
本研究においてはAlzheimer病(AD)の危険因子とされる、Phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein (PICALM)がEndocytosis関連因子であることに着目し、ADの原因タンパクとされるTauの異常凝集体の細胞間伝播とPICALMの関係について解析した。
(1)「凝集核(Seed)」として試験管内で凝集させたRecombinant Tauを導入するAD細胞モデルに対してPICALMを発現させたところ、発現なしのものと比較して異常凝集Tauの量が低下することが明らかになった。(2)GFPとの融合タンパクとして全長PICALM(1-652)を細胞に発現させることで、それ自身がSarkosyl不溶性かつ蛍光顕微鏡で確認できる円形の凝集体を形成することが確認された。また、PICALMのN末端(1-413)およびC末端(414-652)を同様にGFP融合タンパクとして発現させたところ、C末端は全長と同様に凝集を起こした一方で、N末端は凝集を示さなかった。
以上のことからPICALMに関して、TauのADモデルに発現することでTauの異常凝集を減少させ、またPICALM自身がそのC末端に凝集能を持つという性質が確認された。Tau凝集の減少について、PICALMの過剰発現が細胞内へのSeedの取込みを抑制した結果であるという仮説を立てている。PICALMがエンドサイトーシス関連因子であることから、細胞内へのエンドサイトーシスによるSeedの取込みと、その過程へのPICALMの関与に焦点を当てて研究を続けている。一方、当初は予期していなかったPICALMのC末端の凝集能に関しても、Tauの異常凝集との関わりがあるかについて検証中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①PICALMとTauとの関連について、研究計画に沿って以下の目標を達成した。
(1)Transfection(TF)試薬を使わないAD細胞モデルの作製: 全長Tau(1-442)の代わりに凝集能の高いTauのC末端断片(CTF)をSH-SY5Yに発現させることで、Seed導入にTF試薬を使用しなくても十分量の異常凝集Tauを検出可能な細胞モデルの作製に成功した。このモデルを使用することにより、TF試薬の影響を廃した、Seedと細胞との直接的な相互作用(取込みとそれに誘導される異常凝集)の評価が可能になった。
(2)PICALMコンストラクトの作製とAD細胞モデルへの導入: 全長PICALMはC末端部にMyc-DDKタグを付加することで、SH-SY5Yに可溶性タンパクとして十分量発現させることに成功した。このPICALMをTau-CTFと共発現させ、seedをTF試薬なしで導入したところ、PICALMを発現させた細胞で形成された凝集Tauの量が低下した。
②加えて、当初は予定していなかった、以下の結果を得ることができた。
(3)PICALMのC末端領域の自己凝集能: GFPとの融合タンパクとしてPICALMをSH-SY5Yに発現させたところ、蛍光顕微鏡でFociとして確認でき、Sarkosyl不溶性画分に回収される凝集体を形成した。PICALMのN末端(1-413)およびC末端(414-652)にGFPを付加したところ、414-652は全長と同様に凝集体を形成したが、1-413ではそのような凝集は見られなかった。このことは414-652の配列中に自己凝集に関わる配列が存在することを示唆している。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)PICALMの共発現によりTauの凝集が減少する分子メカニズムを解析する: エンドサイトーシス関連タンパクであるPICALMの機能を考慮し、「PICALMの過剰発現の影響でエンドサイトーシスが阻害された結果、Tau凝集体の取込みが減少した」という仮説に基づいて研究を推進する予定である。まずPICALMの過剰発現により、実際にエンドサイトーシスの阻害が起こっているかどうかを、蛍光標識されたトランスフェリン等を用いて解析する。加えて、TauのSeedを蛍光標識し、PICALM発現細胞において実際に取り込みが減少しているかどうかを確認する。また、PICALMのC末端領域がクラスリンの結合領域であることから、N末端(1-413)およびC末端(414-652)を発現させた場合、エンドサイトーシスおよびTauの取込みがどう変化するかどうかを確かめる。これにより、PICALMがTauの取込みを制御することで伝播に関与しているか検証する。
(2)PICALMのC末端領域が持つ自己凝集能についての解析: 自己凝集能を持つGFP-PICALMのC末端領域について、どの部位が凝集に関与しているかどうかを欠損変異体を用いて解析する。加えて、Tauの神経原線維変化とPICALMが共存する病理像の報告から、Tauを共発現することにより、PICALMの凝集体にTauが巻き込まれるかどうかを細胞モデルを用いて検証する。細胞で得られた結果によっては、リコンビナントPICALMを精製し、試験管内での凝集およびそれをseedとして、PICALM、Tau発現細胞内で凝集を誘導するかどうかを確かめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年度に予定していたTransgenic miceの作製について、主に以下の理由から平成30年度以降に延期することなったため、そのために計上していた金額が使われずに残った。(1)大学の新研究棟工事の影響で、既存の動物室の利用が大きく制限され、研究室で新しくケージを増やすことが困難であったこと、(2)予定していた実験のベースになる、マウスへのRecombinant Tau線維の投与モデルについて、再現性等の確認にさらなる検証が必要となり、場合によっては投与するTau線維の変更等の軌道修正をしなければならないこと。
本年度に関しては、以上の問題の解決の見通しが立ち次第、マウス作出の費用として使用する。
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