| 研究課題/領域番号 |
17K15949
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
岩本 拓也 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (80634716)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 肝線維化 / 肝星細胞 |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子ノックダウンによる細胞の解析
アデニル酸アイソザイムをノックダウンした細胞を用いて、質量分析により網羅的に細胞の代謝産物の解析を行った。現在得られた代謝産物の解析を行っている。さらにそれぞれのサンプルに対してウエスタンブロッティングによるタンパク発現解析も行った。
:星細胞活性化評価用AKアイソザイムプロモータートランスジェニックマウスの作製
AKアイソザイムプロモーターにGFPをつけた肝星細胞が同定できるトランスジェニックマウスを作製を試みた。まずプロモーター:GFPプラスミドをリニアにしてマウス受精卵にインジェクションを行った。100匹以上のマウスを作製し評価したが目的のトランスジェニックマウスは得られなかった。そこでより効率よく作製するためにROSA26配列にプロモーター:GFPを入れるようCRISPR法に変更した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アデニル酸キナーゼの遺伝子発現変化を行った細胞の代謝解析では、アデニル酸キナーゼアイソザイムの過剰発現およびノックダウン細胞の代謝解析を予定通り行うことができた。アデニル酸キナーゼの遺伝子発現変化を行った細胞のメタボローム解析ではアデニル酸アイソザイムをノックダウンした細胞を用いて、質量分析により網羅的に細胞の代謝産物の解析を行うことができた。ミトコンドリア解析としてウエスタンブロッティングによるミトコンドリア局在タンパクや、ミトコンドリアの低酸素応答に重要であるタンパクの発現解析も行った。これまでにAKアイソザイムAとBの発現の差が肝星細胞と肝細胞で違いがあることをこれまでに見つけている。そこでAKアイソザイムプロモーターにGFPをつけたコンストラクトを、マウスRosa26に導入することを試みた。現在100個程度の受精卵に遺伝子導入し評価を行っているところである。今のところ星細胞活性化評価用AKアイソザイムプロモータートランスジェニックマウスの作製ではまだうまくいっていないが、より効率の良い方法に変更できる可能性が示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
トランスジェニックマウスの作製を継続する。トランスジェニックマウス得られれば肝星細胞の評価に使うことができるか評価する。四塩化炭素投与により慢性肝障害を与えたマウスより肝臓を単離して蛍光を調べる。得られた細胞から肝星細胞特異的表面抗原マーカーや遠心分離などを行い単離する。単離した肝星細胞を用いて遺伝子発現解析、タンパク発現解析、メタボローム解析などを行う。障害肝に対する骨髄細胞投与をコラーゲンなどの線維の産生と分解について評価する。作製したトランスジェニックマウスが肝星細胞の評価に使うことができるか評価する。四塩化炭素投与により慢性肝障害を与えたマウスより肝臓を単離して蛍光を調べる。また蛍光により細胞のソーティングを行い、星細胞の活性化を評価する。さらに四塩化炭素投与により慢性肝障害を与えたマウスに同種同系のGFPマウスから採取した骨髄を静脈より投与し、1か月程度経過し線維化が改善するマウスでも線維化改善の効果が見られるか評価する。ここでも得られた細胞から肝星細胞特異的表面抗原マーカーや遠心分離などを行い単離する。単離した肝星細胞を用いて遺伝子発現解析、タンパク発現解析、メタボローム解析などを行う。障害肝に対する骨髄細胞投与をコラーゲンなどの線維の産生と分解について評価する。
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