| 研究課題/領域番号 |
17K15974
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
柳川 享世 東海大学, 医学部, 特定研究員 (10760291)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 肝再生 / 線維肝 / 再生医療 / エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、所属研究室が独自に見出した新規の線維肝再生促進因子Opioid growth factor receptor- like 1 (OGFRL1)について、申請者がこれまでに培ってきた細胞周期・増殖制御の研究に細胞分化の観点を加えた機能解析を行う。最終的には、相互作用因子やシグナル伝達系を明らかにすることで、OGFRL1による線維化改善と再生促進機序を解明し、次世代型肝硬変治療法の開発に向けた分子基盤の確立を目的としている。２年目の今年度は、主に以下の２点について達成した。
1) 複数系統のOGFRL1ノックアウトマウスを樹立した。マウスOgfrl1は７つのエクソンからなり、CRISPR/Cas9を用いて、第１エクソンと第６エクソンそれぞれに終止コドンが出現するようゲノム編集を行った。第１エクソン以降を欠損すると、Ogfrl1の保存領域も含めてほぼすべてのOGFRL1タンパク質が産生できなくなると予想された。一方、第６エクソン以降を欠損するとOgfrl1の保存領域までは転写・翻訳され、C末端側のアミノ酸を欠損することになり、より詳細な機能解析を行える可能性がある。第１エクソン、第６エクソン以降の欠損ともに複数系統のノックアウトマウスが得られ、現在は繁殖率の検討や表現型の観察を行っている。
2) マウスOGFRL1をエクソソームに高効率に内包させるプラスミドを作製した。これをHEK293細胞に導入してOGFRL1を産生させた結果、cell lysate並びに培養上清中に分泌されたOGFRL1は、マウス血中に分泌される内因性のOGFRL1とサイズが異なることが明らかとなった。これは、内因性のOGFRL1が何らかの修飾を受けていることを示唆しており、次年度以降に内因性OGFRL1と相互作用するタンパク質の探索やリン酸化、糖鎖などの修飾についてMS解析などを予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H30年度の達成目標の１つであった、最新のゲノム編集技術であるEasi-CRISPR法を用いたOGFRL1ノックアウトマウスを樹立することが出来た。発生における機能や肝その他の臓器の傷害時におけるの機能解析のため、異なる編集を受けてOGFRL1がノックアウトされた複数系統を繁殖中である。順次、表現型の観察を行っている。また、マウスOGFRL1の培養細胞における産生系を確立し、既に作製していた抗マウスOGFRL1抗体の反応性をウェスタンブロット等により検証できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も、in vivoとin vitroの両面から解析を進める。H29年度に樹立できたOGFRL1ノックアウトマウスを用いて、まずは個体における表現型を解析する。具体的には、繁殖率、胎仔の発生過程、肝傷害時などにおいて、野生型と比べてどのような差異があるか詳細に表現型を観察する。並行して、H29年度に確立したOGFRL1過剰産生系を用いてOGFRL1タンパク質を産生ならびに回収し、共免疫沈降法やGST pull-down法、質量分析法などを用いてOGFRL1と相互作用する因子の探索やOGFRL1自身の修飾の解析を行う。個体の表現型解析と種々の生化学的手法の組合わせにより、OGFRL1の肝再生における機能や作用機序を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H30年度は、複数系統のOGFRL1ノックアウトマウスを樹立することが出来た。これらを維持・繁殖させるために、H29年度から繰り越した予算を使用してきたが、ノックアウトマウスの個体を用いた解析を行うためにはホモ欠損（メンデルの遺伝則に従うと、各世代に１／４の確率で生じる）個体を使用する必要があり、更なる繁殖を行わなければならない。OGFRL1ノックアウトマウスの系統が当初見込みより多く得られたことで、各種の解析もより多検体について行うこととなり、H30年度の計画から更に増額して対応する必要に迫られている。当初の計画を変更して次年度へ繰り越しを行い、最終年度であるH31年度には複数系統のOGFRL1ノックアウトの繁殖ならびに種々の解析に用いる予定である。
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