| 研究課題/領域番号 |
17K15995
|
|---|
| 研究機関 | 金沢大学 |
|---|
研究代表者 |
永田 庸二 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (50632478)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | ミトコンドリア / 拡張型心筋症 |
|---|
| 研究実績の概要 |
生後1日齢のマウス心臓より分離培養して得られたneonatal mouse cardiomyocyteを用いて、SiRNAによるUSMG5ノックダウンモデルを作成し、マイクロアレイにて、心筋関連分子、ATP関連分子、心不全関連分子の網羅的な遺伝子発現解析さらに、その結果をふまえてパスウェイ解析を行った。心不全関連分子、ATP産生に関連した分子の遺伝子発現を確認し、マイクロアレイとは別の手法による結果の再確認を行った。natriuretic peptide precursor A（NPPA）、B(NPPB)ではquantitative PCR法にて上昇していることを確認できたことから、USMG5ノックダウンneonatal mouse cardiomyocyteは、in vitro においても心不全状態であることが示唆された。現在、USMG5ノックダウンneonatal mouse cardiomyocyteにおいてATP産生能の測定に関する条件検討を行った。SiRNAによるUSMG5ノックダウン後からATP産生の時間経過を測定し、心不全関連分子、アポトーシス関連分子などとの発現時期の差異に関する検討を行った。neonatal mouse cardiomyocyteを用いた結果が、以前我々が報告したゼブラフィッシュを用いた結果と比較し、異なる結果が認められた項目に関しては、動物種や細胞と動物個体などに関する差異とも考えられ、現在さらなる検討を加えている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
生後1日齢のマウス心臓より分離培養して得られたneonatal mouse cardiomyocyteを用いて、SiRNAによるUSMG5ノックダウンモデルを作成し、マイクロアレイにて、心筋関連分子、ATP関連分子、心不全関連分子の網羅的な遺伝子発現解析さらに、その結果をふまえてパスウェイ解析を行った。心不全関連分子、ATP産生に関連した分子の遺伝子発現を確認し、マイクロアレイとは別の手法による結果の再確認を行った。natriuretic peptide precursor A（NPPA）、B(NPPB)ではquantitative PCR法にて上昇していることを確認できたことから、USMG5ノックダウンneonatal mouse cardiomyocyteは、in vitro においても心不全状態であることが示唆された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、USMG5ノックダウン心筋細胞における細胞内ATP活性の評価を行う。ホタルルシフェラーゼアッセイを用いて細胞内ATP活性を評価し、USMG5ノックダウン心筋細胞におけるATP産生能の低下を証明する。更に細胞外フラックスアナライザーを用いて細胞内OCRを計測し、USMG5ノックダウン心筋細胞における酸素代謝機能の低下を証明する。AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling pathwayは、細胞内ATP活性の低下に応じて代償的に賦活化される経路として知られる。したがってUSMG5ノックダウン心筋細胞では細胞内ATP活性の低下から、この経路が賦活化されている可能性がある。Western blotによりAMPK signaling pathwayの賦活化を証明する。3-B. Usmg5ノックダウン心筋細胞におけるROS蓄積の評価を行う。MitoSox Red染色を用いてミトコンドリア内ROS蓄積量の評価、およびDCFH-DA染色を用いて細胞内ROS蓄積量の評価を試みる。またFluo-4染色を用いて細胞内ROS蓄積の結果として生じる細胞内Ca濃度の上昇を証明する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度では、マウス心筋細胞を用いたATP産生能に対するDAPITの影響を検討する予定であったが、SiRNAによるDAPITノックダウンの条件検討する過程において、（１）マウス心筋細胞の初代培養の採取、（２）SiRNAの導入効率、（３）適切なノックアウトの確認、以上の点で難渋した。特に、主として（１）での条件検討を行い、以後予定であった（２）、（３）の過程が予定通り進行せず、このために予定経費が未使用として残存となりました。
|
