| 研究課題/領域番号 |
17K16051
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
三浦 綾子 宮崎大学, 医学部, 研究員 (70710903)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 肺上皮 / 肺発生 / Pten / 老化 / Notchシグナル |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、正常肺発生における上皮Ptenの役割を、「上皮細胞運命制御」と「プログラムされた細胞老化」という本質的な視点から網羅的に解析し、普遍的な臓器形成の分子機構解明に資することを目的とする。胎生期に肺胞上皮細胞(AEC)でPtenを欠損させたマウスは、肺胞形成不全を呈することが報告されている。哺乳類の正常な胚発生のためには、1.適切な細胞運命決定(Development, 2014)、2.「プログラムされた細胞老化」(Cell, 2013)が重要である。肺発生時の上皮幹細胞・前駆細胞の分化におけるPtenの機能解析の報告はない。一方、「プログラムされた細胞老化」とは、細胞傷害やストレスに非依存性に、制御下に特定領域の細胞老化が生じ、免疫細胞浸潤によって老化細胞が取り除かれ、正常胚発生過程において組織リモデリングが生じるものである。最近、申請者はAEC特異的Pten欠損マウスを用い、AECでのPten発現がNotchシグナルを介し上皮細胞の分化方向制御に必須であることを明らかにした。本研究では、SHHGFPCre/Pten△/△マウスを用い、上皮Ptenが与える肺構成細胞の細胞運命制御と、肺形態形成に重要な「プログラムされた細胞老化」への影響を解析する。肺発生に関与する分子とPtenの連関を明らかにし、①上皮細胞と間葉細胞の分化方向制御機構の解析、②発生におけるPtenと細胞老化プログラム機構の解析、③Pten siRNA導入肺上皮細胞(BEAS2B細胞)でのPten-Notchシグナルと細胞老化機構の解析④肺発生時の紡錘体形成機構の解析、⑤老化阻害剤による肺発生異常に対するレスキュー効果の検討⑥時期特異的肺上皮Pten欠損マウスを用いた上皮Pten欠損が与える多分化前駆細胞/肺胞前駆細胞/細気管支前駆細胞分化能への影響の解析を行い、肺発生におけるPtenの恒常性維持への役割を解明する。特に肺発生における老化現象は報告が少なく未解明なため新たな知見となることが期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
P0、E18.5、E16.5、E14.5各発生段階における肺上皮細胞と間葉細胞の分化マーカーおよび上皮細胞の分化方向制御因子の免疫染色を行った。SHHGFPCre/Pten△/△マウス肺(E18.5)を用いた、電子顕微鏡解析によりⅡ型AECがみられず、未分化の肺胞前駆細胞、Club細胞、杯細胞の過形成と線毛上皮細胞の減少がみられた。E18.5でのSHHGFPCre/Pten△/△マウスとSHHGFPCre/Ptenwt/wtマウス肺をFACSにて肺上皮細胞のみ単離し、RNAシークエンス、定量PCR解析を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
老化阻害剤による肺発生異常に対するレスキュー効果の検討を行い、肺発生におけるPtenの恒常性維持への役割を解明する。組織切片にておこなったSA-β-GAL染色をFACSにて再検討を行う。さらに、PTEN shRNA導入細胞へp53 shRNAまたはp21 shRNAを導入し、p53またはp21のノックダウンによる細胞老化のキャンセル効果をSA-β-GAL染色により評価する。また、Ptenが細胞分裂関連遺伝子EG5のリン酸化に必要であるという報告から、E18.5全肺を用いてWestern blotを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
E18.5肺をFACSにて上皮細胞に単離し、そのmRNAをRNAシークエンス解析(外注)を行なったため。
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