肺MAC症新規疾患感受性遺伝子の同定と解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K16066
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 吉田 光範 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 主任研究官 (70772630)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 肺MAC症 / 疾患感受性遺伝子

研究実績の概要

本研究は、日本人集団の肺MAC症疾患感受性遺伝子を網羅的に探索し、肺MAC症の病態機構を明らかにすることを目的とした。日本人肺MAC症患者のケース・コントロール関連解析およびDigiTag2法による再現解析から、肺MAC症に有意に関連する一塩基多型（SNP）の存在が証明された。本年度はまず、A549細胞株およびTHP-1細胞株由来のマクロファージに対して、検出されたSNPの上流および下流に位置する遺伝子（ここでは遺伝子Aおよび遺伝子Bとする）について、M. avium 104株感染時における発現解析をおこなった。感染させる菌量はMOI=50、100、および 200とし、感染後30分、2時間、および1日経過後の感染細胞から抽出したRNAを使用して遺伝子Aおよび遺伝子Bの発現量をリアルタイムPCR法により測定した。上記の条件では非感染細胞との間に遺伝子Aおよび遺伝子Bの発現量について有意な差を見出せなかった。M. avium TH-135株についても上記の実験を行ったが結果は同様であった。また、siRNAによりA遺伝子の発現を抑制したA549細胞株およびTHP-1細胞株を作成した。作成した細胞株の通常培養条件におけるA遺伝子発現量は、A549細胞株では1/5程度、THP-1細胞株では1/2程度に抑制されていた。これらの細胞株にM. avium 104株およびM. avium TH-135株を1日感染（MOI=100）させたのちに3日培養し、細胞内の菌量をCFUの形で測定した。A遺伝子の発現を抑制したA549細胞株において比較対照の細胞株と比べてCFUが増加傾向にあったが、統計的に有意な差を検出するには至っていない。今後は上記の実験に加えて、感染後比較的早い段階(感染後数時間経過)におけるCFUの測定も行う予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本年度より実施した、A549細胞株およびTHP-1細胞株由来のマクロファージに対して、遺伝子Aおよび遺伝子BのM. avium感染時における発現解析に関して実験条件の検討に当初の予定よりも時間を要した。現在のところA549細胞株およびTHP-1細胞株由来のマクロファージではM. avium感染時に遺伝子Aおよび遺伝子Bの発現変動は検出できていない。今後は、感染させる菌量や感染時間をさらに検討していくとともに、A549細胞株およびTHP-1細胞株以外の細胞株やマウスの初代培養細胞の使用を検討した実験を行う。
また、A549細胞株およびTHP-1細胞株にsiRNAを導入する実験についても使用機器や実験条件の検討に時間を要した。現在ではsiRNA導入および、遺伝子Aおよび遺伝子Bの過剰発現プラスミドを導入した細胞株の作成に成功している。

今後の研究の推進方策

今年度前半は、昨年度より引き続き遺伝子Aおよび遺伝子BのM. avium感染時における発現解析を行う。昨年度に感染実験にて使用した細胞株に加えて、A遺伝子およびB遺伝子を過剰発現させた細胞株に対しても同様の感染実験を行う。さらに今年度は、A549細胞株およびTHP-1細胞株由来のマクロファージにM. aviumを感染させたときの発現変動遺伝子を網羅的に調べるために、RNAseq解析を行う。また、CRISPR-Cas9システムを利用してA549細胞株およびTHP-1細胞株においてGWAS解析により検出されたSNPを導入した変異細胞株を作成し、M. aviumを感染させてRNAseq解析を行う。上記のRNAseq解析によって発現変動が検出された遺伝子に対してノックダウンまたは過剰発現させた細胞株を作成し、M. aviumを感染後一定時間経過後の細胞内の菌量をCFUの形で測定する。
CRISPR-Cas9システムを利用したA遺伝子ノックアウトしたマウスの作成に成功している(研究協力者)。現在、繁殖・系統維持を行っている段階である。実験に必要な匹数が揃った段階で、マウスの肺胞上皮、骨髄由来マクロファージ、およびラットにおいてA遺伝子の発現が確認されている小腸上皮の細胞を採取してA遺伝子の発現解析を行う。その後、マウスへのM. avium感染実験を行い、一定時間経過後の肺組織におけるCFUの測定と生存時間解析を行う。

次年度使用額が生じた理由

当初購入を計画していた超低温フリーザーについて、購入を見送ったため。本研究で使用する細胞株および菌株の保存場所は十分に確保できており、所属施設における設置場所の制限により購入を再度検討している段階である。また、実験に関する消耗品を含む物品費が計画よりも多くかかっており、物品費に充てることを検討している。

研究成果

• [雑誌論文] Discrimination of Mycobacterium leprae and Mycobacterium haemophilum in clinical isolates/specimens by multiple PCR assay and prediction of drug susceptibility. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kitaoka N, Fukano H, Yoshida M, Miyamoto Y, Mori S, Ishii N, Ato M, Ohara N, Hoshino Y.
  • 雑誌名: J Clin Microbiol 巻: 57(2) ページ: -
  • DOI: 10.1128/JCM.01760-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] A rapid and non-pathogenic assay for association of Mycobacterium tuberculosis gyrBA mutations and fluoroquinolone resistance using recombinant Mycobacterium smegmatis. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yoshida M, Nakata N, Miyamoto Y, Fukano H, Ato M, Hoshino Y.
  • 雑誌名: FEMS Microbiol Lett 巻: 365(23) ページ: -
  • DOI: 10.1093/femsle/fny266
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mycobacterium shigaense sp. nov., a slow-growing, scotochromogenic species, is a member of the Mycobacterium simiae complex. (2018)
  • 著者名/発表者名: Fukano H, Yoshida M, Kazumi Y, Fujiwara N, Katayama K, Ogura Y, Hayashi T, Miyamoto Y, Fujimoto N, Hongsheng W, Mizumoto C, Koizumi Y, Maeda H, Hiranuma O, Mitarai S, Ishii N, Hoshino Y.
  • 雑誌名: Int J Syst Evol Microbiol. 巻: 68(8) ページ: 2437-2442
  • DOI: 10.1099/ijsem.0.002845
  • 査読あり
• [雑誌論文] Complete Genome Sequence of Mycobacterium shigaense. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yoshida M, Fukano H, Ogura Y, Kazumi Y, Mitarai S, Hayashi T, Hoshino Y.
  • 雑誌名: Genome Announc. 巻: 6(25) ページ: -
  • DOI: 10.1128/genomeA.00552-18
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Naturally occurring a loss of a giant plasmid from Mycobacterium ulcerans subsp. shinshuense makes it non-pathogenic. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakanaga K, Ogura Y, Toyoda A, Yoshida M, Fukano H, Fujiwara N, Miyamoto Y, Nakata N, Kazumi Y, Maeda S, Ooka T, Goto M, Tanigawa K, Mitarai S, Suzuki K, Ishii N, Ato M, Hayashi T, Hoshino Y.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 8(1) ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41598-018-26425-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Draft Genome Sequence of Mycobacterium montefiorense Isolated from Japanese Black Salamander (Hynobius nigrescens). (2018)
  • 著者名/発表者名: Fukano H, Yoshida M, Shimizu A, Iwao H, Katayama Y, Omatsu T, Mizutani T, Kurata O, Wada S, Hoshino Y.
  • 雑誌名: Genome Announc. 巻: 6(21) ページ: -
  • DOI: 10.1128/genomeA.00448-18
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] ブルーリ潰瘍の原因菌Mycobacterium ulcerans subsp. shinshuenseの比較ゲノム解析. (2018)
  • 著者名/発表者名: 吉田光範, 星野仁彦
  • 学会等名: 第93回日本結核病学会総会