新規アルツハイマー病モデルの開発とDNA傷害の解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K16113
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 間野 達雄 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20704331)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: アルツハイマー病 / DNA傷害 / 細胞モデル / 三次元培養

研究実績の概要

アルツハイマー病患者の脳において、アミロイドβおよびリン酸化タウの蓄積という病理学的変化は古くから知られるところであるが、そのようなタンパク質が神経細胞においてどのように神経細胞機能を傷害しているのかは明らかではなかった。神経細胞におけるDNAメチル化変化をスクリーニングとして、DNA修復タンパク質であるBRCA1の機能異常が起きていることを見出した。アルツハイマー病患者の脳において、神経細胞でBRCA1は不溶化しており、リン酸化タウとともに細胞質に凝集していた。更にはアミロイドβは神経細胞におけるDNA傷害を誘導していることも明らかになり、アルツハイマー病におけるDNA傷害と、その修復機構であるBRCA1の機能不全が病態に関与していると考えられた。DNA傷害の蓄積を中心としたアルツハイマー病の病態を解析するためのモデル構築を本研究の目標とした。
ヒト由来の神経前駆細胞に変異型アミロイド前駆タンパク(Amyloid precursor protein; APP)遺伝子をレンチウィルスを用いて導入し、アミロイドβの過剰産生を行う神経細胞を作成した。本細胞を用いて、三次元培養系を構築し、神経細胞への分化を各種神経細胞マーカーを用いて確認した。また成熟した神経細胞は分裂することができず、分裂可能が多くの体細胞とは異なったDNA傷害・修復系が存在すると考えられ、DNA傷害・修復マーカーについても、免疫染色による確認をおこなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

神経前駆細胞に対して、変異型APP遺伝子をレンチウィルスで導入し、抗生剤およびFluorescence activated cell sorting (FACS)によって遺伝子導入に成功した細胞を選択した。導入した遺伝子が発現してタンパクを合成していることについては、ウェスタンブロットによって確認を行った。また、本細胞の神経細胞への分化を誘導し、各種神経細胞マーカーによる免疫染色で確認を行った。更に三次元細胞培養系を確立するため、細胞外基質に細胞を包埋しての培養を行って、このような培養系においても各種神経細胞マーカーの発現が誘導されてくることを確認した。
神経細胞におけるDNA傷害・修復を評価するモデル系とするため、コントロールとしてDNA傷害性薬剤によるDNA傷害の誘導を行って、DNA傷害・修復に関連するタンパク質に対する抗体で免疫染色を行って評価した。

今後の研究の推進方策

アルツハイマー病におけるDNA傷害がどのような時系列で生じているのかを評価することを目的として、DNA障害部位に集積するタンパク質に対して蛍光タンパク質を融合したプローブを作成することとしている。本プローブを昨年度に作成した細胞モデルに適応することによって、アミロイドβによるDNA傷害がどのように蓄積するのかを検討することが可能になると考えている。本細胞モデルを用いて、アルツハイマー病における不溶性タンパクの蓄積についても検討を行っていく。

次年度使用額が生じた理由

納期変更にともなって年度内の納品ができなかった製品があったため。発注を中止し、次年度に改めて発注することとした。

研究成果

• [雑誌論文] DNA methylation level of the neprilysin promoter in Alzheimer's disease brains (2018)
  • 著者名/発表者名: Nagata Kenichi、Mano Tatsuo、Murayama Shigeo、Saido Takaomi C.、Iwata Atsushi
  • 雑誌名: Neuroscience Letters 巻: 670 ページ: 8～13
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2018.01.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Degeneration of the Substantia Nigra Following Ipsilateral Striatal Infarction (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohtomo Gaku、Mano Tatsuo、Seto Akiko、Tsuji Shoji
  • 雑誌名: Internal Medicine 巻: 57 ページ: 767～768
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.9442-17
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reversible white matter lesions in ketotic-hyperglycemic seizure: metabolic and hemodynamic studies with MRI implied its reversibility. (2018)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Kodama, Tatsuo Mano, Toshiyuki Kakumoto, Hiroyuki Ishiura, Akifumi Hagiwara, Kouhei Kamiya, Toshihiro Hayashi, Shoji Tsuji
  • 雑誌名: Journal of the Neurological Sciences 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.jns.2018.04.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tacrolimus-Induced Reversible Cerebral Vasoconstriction Syndrome with Delayed Multi-Segmental Vasoconstriction (2017)
  • 著者名/発表者名: Kodama Satoshi、Mano Tatsuo、Masuzawa Akihiro、Hirata Yasutaka、Nagasako Yuki、Koshi Mano Kagari、Hamada Masashi、Terao Yasuo、Hayashi Toshihiro、Ono Minoru、Tsuji Shoji
  • 雑誌名: Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases 巻: 26 ページ: e75～e77
  • DOI: doi.org/10.1016/j.jstrokecerebrovasdis.2017.03.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Case of a 78-year-old woman with a neuronal intranuclear inclusion disease (2017)
  • 著者名/発表者名: Takumida Hiroshi、Yakabe Mitsutaka、Mori Harushi、Shibasaki Koji、Umeda-Kameyama Yumi、Urano Tomohiko、Mano Tatsuo、Hayashi Akimasa、Ikemura Masako、Ogawa Sumito、Akishita Masahiro
  • 雑誌名: Geriatrics & Gerontology International 巻: 17 ページ: 2623～2625
  • DOI: 10.1111/ggi.13174
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuron-specific methylome analysis reveals epigenetic regulation and tau-related dysfunction of BRCA1 in Alzheimer’s disease (2017)
  • 著者名/発表者名: Mano T, Nagata K, Nonaka T, Tarutani A, Imamura T, Hashimoto T, Bannai T, Koshi-Mano K, Tsuchida T, Ohtomo T, Takahashi-Fujigasaki J, Yamashita S, Ohyagi Y, Yamazaki R, Tsuji S, Tamaoka A, Ikeuchi T, Saido T, Iwatsubo T, Ushijima T, Murayama S, Hasegawa M, Iwata A
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 114 ページ: E9645～E9654
  • DOI: 10.1073/pnas.1707151114
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 慢性脳低灌流が脳内アミロイドβ蛋白の動態に及ぼす影響 APP/PS1マウスを用いた病理学的検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 坂内太郎、大友亮、大友岳、間野達雄、岩田淳
  • 学会等名: 第43回日本脳卒中学会
• [学会発表] In vitro AD model using human neural progenitor cell (2017)
  • 著者名/発表者名: Tatsuo Mano, Atsushi Iwata
  • 学会等名: WCN2017(World Congress of Neurology 2017)
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of neuron-specific histone modifications (2017)
  • 著者名/発表者名: Kagari Koshi-Mano, Tatsuo Mano, Atsushi Iwata
  • 学会等名: WCN2017(World Congress of Neurology 2017)
  • 国際学会
• [学会発表] Utility of ferroxidase activity assay in the diagnosis of aceruloplasminemia with detectable serum ceruloplasmin levels (2017)
  • 著者名/発表者名: Rimi Inoue, Tatsuo Mano, Aki Mitsue, Masaki Tanaka, Takashi Matsukawa, Jun Mitsui, Atsushi Iwata1, Toshihiro Hayashi, Shoji Tsuji
  • 学会等名: WCN2017(World Congress of Neurology 2017)
  • 国際学会
• [学会発表] Chronic cerebral hypoperfusion accelerates amyloid beta deposits in app/ps1 transgenic mice (2017)
  • 著者名/発表者名: Taro Bannai, Ryo Ohtomo, Tatsuo Mano, Shoji Tsuji, Atsushi Iwata
  • 学会等名: WCN2017(World Congress of Neurology 2017)
  • 国際学会
• [図書] 医学のあゆみ：神経変性におけるDNAメチル化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 間野かがり，間野達雄，岩田淳
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 医歯薬出版株式会社
• [図書] 実験医学：Current topics 神経細胞特異的メチル化解析から明らかになったアルツハイマー病におけるDNA修復の障害 (2018)
  • 著者名/発表者名: 間野達雄, 岩田淳
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 実験医学増刊：認知症のエピジェネティクス (2017)
  • 著者名/発表者名: 間野達雄, 岩田淳
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 羊土社