| 研究課題/領域番号 |
17K16315
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| 研究機関 | 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所 |
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研究代表者 |
野田 万理子 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 分子病態研究部門, 研究員 (50571311)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | COPS7A / Per3 / Autism / 神経細胞移動 / 大脳皮質形成 / 発達障害 |
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| 研究実績の概要 |
COPS７Aは、核内タンパク質の一つであり、COP9シグナロソームと呼ばれる大型の複合体を形成して、ユビキチン－プロテアソームによる細胞内タンパク質分解に重要な役割を果たす。COPS7Aは進化の過程で高度に保存されており、細胞内タンパク分解以外にも様々な生命現象の根幹に関与していることが示されているが、その作用機構や疾患への寄与に関しては殆ど明らかにされていない。最近の自閉性障害(ASD)患者の網羅的解析から、健常群と比較して顕著なCOPS7A発現減少が報告されている。しかし、大脳皮質発達におけるCOPS7Aの生理機能・発現状態は全く不明であり、病態形成に至るメカニズムに関しても解析がなされていないため、本研究ではCOPS7Aが大脳皮質発達に及ぼす役割の解明を目指し、解析を行った。まず、COPS7AのRNAiベクターを３種作成して、子宮内マウス胎仔脳遺伝子導入法により神経幹細胞へと導入しCOPS7Aの発現抑制を行った。その結果、神経細胞移動が障害され、神経細胞軸索の進展も抑制された。
Per3は時計遺伝子の一つである。ASDを始めとした発達障害患者は高い割合で睡眠障害を併発することも知られている。しかし睡眠障害と発達障害発症の連関を証明する分子メカニズムに関しては殆ど明らかにされておらず、また胎生期のPer3の役割に関しても未解明のままである。そこで本研究では発達障害の病態形成におけるPer3の機能解明を目的として解析を行った。In situ hybridizationにより胎生期マウス大脳皮質におけるPer3のmRNA発現状態を明らかにした。これ以外に共焦点レーザー顕微鏡を用いた脳スライスライブイメージングと分子生物学的・生化学的解析による包括的な解析によりPer3の皮質神経細胞の移動や成熟に及ぼす機能を明らかにし、原著論文として報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
COPS7Aに関しては神経細胞発達における基礎的な解析（神経細胞移動や神経突起伸長に及ぼす影響、細胞形態解析）はすでに終了しており、市販抗体を用いた発現解析(western blotting)により発生段階の比較的早い時期からマウス脳に発現していることが明らかとなった。しかし、COPS7Aの作用機構の詳細は現時点で明らかになっていないため、病態形成機構の解明には至っていない。
Per3は、適切な抗体が存在しないため、in situ hybridizationにより、発達期マウス脳での発現解析を行った。発生の初期段階からマウス大脳皮質での発現が確認され、発生が進むに従って成熟神経細胞に強く発現することが明らかとなった。これまでに行ってきたPer3の神経細胞機能に及ぼす包括的な解析のデータをまとめて、発達障害の病態関連分子としてのPer3の機能解析を原著論文として報告した。臨床グループとの連携で見出された睡眠障害を有するASD患者で見られるPer3の変異(p.R366Q)は、in vitroおよびin vivo神経細胞を用いた解析によりPer3タンパク質の不安定化を引き起こす変異であることが明らかとなった。しかし、この変異（p.R366Q）はヒトのエキソーム解析データベース（ExAC）より、疾患特異的な変異ではないことが判明したため、それ以上の解析は行わなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
COPS7Aに関しては脳組織を用いた抗体免疫染色やin situ hybridizationにより詳細な発現解析を行うことを予定している。これに加えて分子生物学的・生化学的解析による包括的な解析を行い、COPS7Aの性状解析を原著論文としてまとめていく。
Per3に関しては、これまでに得られた結果をまとめて原著論文として報告した。これらの分子はいずれもシグナル伝達機構の詳細が明らかとなっていないため、その探索を行うことで、未知の発達障害の病態形成機構の一端が明らかとなる可能性がある。分子機構の探索に準備期間と資金を必要とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Per3の研究計画が予想以上に早く進展し、原著論文として報告できた一方で、抗体の選定などに時間がかかりCOPS7Aの発現解析が思うように進まなかったため。また本年度より新たに整備されたSPF環境下でのマウスの繁殖および維持にある程度まとまった金額が必要となり、繰越を行う必要が生じた。
今年度はCOPS7Aの性状解析に使用できる抗体の選定が完了したため、これを用いて発現解析を行っていく。解析に必要な試薬の購入や妊娠マウスの購入に予算を計上する。さらにPer3やCOPS7Aのシグナル伝達機構探索のため、候補となる上流・下流分子の分子生物学的な解析を行う。このためのキット類や特異抗体の購入にも予算を計上する。
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