炎症性腸疾患における抗原提示細胞の異常活性化の機序および機能解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K16546
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 関戸 悠紀 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (00781709)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: Crohn’s Disease / IBD / innate myeloid cell / human colon / RNA-seq analysis

研究実績の概要

１．クローン病および正常ヒト腸管からのCD14+CD163low細胞の分取蓄積
① ヒト腸管サンプル回収処理プロトコルの確立：ヒト腸管手術標本の残余部分を用いる研究であり、臨床上必要な病理標本処理を行った上手でできるだけ細胞のviabilityが高い状態で細胞を回収する標本処理プロトコルの確立を目指し、RNAシークエンスに妥当なcDNAが作成可能なクオリティの細胞分画サンプルがとなるまでにシークエンスを行わない先行実験を行った。最終的にヒトゲノム研究の同意書を取得した上でクローン病3症例からクローン病腸管を、大腸癌4症例から非癌部の腸管を採取した。
② CD14+CD163low細胞のsorting：既にわれわれが確立したヒト腸管からの抗原提示細胞分取方法(T Ogino, et al. Gastroenterology 2013)に準じて腸管粘膜固有層の筋層からの剥離、小片化、酵素処理、密度勾配法による分画を行ったのちフローサイトメトリーでLineage(CD19, CD20, CD56)陰性かつHLA-DR陽性のゲートを選択し、さらにCD14、CD1D11c、CD163で展開し目的の分画をsortingした。細胞のviabilityを保つため、術当日にsortingし、死細胞を除くことでcDNA作成に十分なクオリティの細胞分画を採取した。
２．RNAシークエンスによる網羅的遺伝子発現解析による異常発現遺伝子の同定
① RNAシークエンス：得られた細胞分画サンプルについて大阪大学免疫フロンティア研究センターにおいてHiSeq2500/4000を用いたRNAシークエンスを行い、網羅的遺伝子発現解析を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究計画書における平成29年度の研究計画で予定していた「１．クローン病および正常ヒト腸管からのCD14+CD163low細胞の分取蓄積」、および「２．RNAシークエンスによる網羅的遺伝子発現解析による異常発現遺伝子の同定」について、先行実験からシークエンスに十分なクオリティを持った細胞分画を得る実験プロトコルを確立し、クローン病3例、正常コントロール4例でのRNAシークエンスを施行し、解析可能なデータを得ているため。

今後の研究の推進方策

クローン病3例、正常コントロール4例についてRNAシークエンスを行って得られた遺伝子発現データについて、発現変動遺伝子の統計学的処理、および発現変動遺伝子のGene Ontology解析を行ない、1.正常例の分析から細胞分画間の発現変動から各細胞分画の機能、役割について検証する、2.各細胞分画におけるクローン病群と正常コントロール群との発現変動から、クローン病において各分画の機能、役割がどのように異なっているのかを解析することを計画している。必要があれば症例数の追加を行う。