| 研究課題/領域番号 |
17K16609
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
河北 直也 徳島大学, 病院, 助教 (60522266)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 肺胞上皮細胞 / 幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
まず研究の初期段階である，胎齢15日・17日・19日・生後0日・7日のラット肺組織を用い,ラット肺組織におけるbipotential細胞の局在を免疫蛍光染色にて同定を試みている． Bipotencial細胞はPdpn（I型肺胞上皮細胞）およびSftpc（II型肺胞上皮細胞）が共に陽性である細胞である．今回まず正常肺でのBipotential細胞の局在を確認するために，H-E染色とともに，Podoplanin/Sftpc陽性の二重染色を試みた．その結果，I型・II型それぞれの細胞の肺胞壁における局在・分布像は確認することができたが，現時点ではBipotential細胞の局在をとらえられなかった．これは，Bipotential細胞が正常肺では極めて少ないことに起因していると考えられ，ほぼ予測された結果であった．しかしながら，一次抗体の変更や，濃度調整を行い，引き続き検討している．その上で，分化・増殖の旺盛な胎仔肺組織を用いて染色を試み，Preliminaryではあるが，Bipotential細胞を確認することができている．今後は経時的変化を観察するとともに，さらなるvalidationとして，二重蛍光in situ hybridizationを検討している．ラットPdpnおよびSftpcに対するin situ hybridizationの知見は少ないが，Treutleinらのプロトコール(Nature. 2014)を参考に始める予定である．それに並行して，TTF-1，CCSP，Wnt7b，などの肺の分化に関わる因子の経時的変化を見るためreal time RT-PCRを施行予定であり，RNA抽出し準備段階となっている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
胎生期ラット肺の採取は問題なく施行できているが，蛍光免疫染色によるbipotential細胞の局在同定，変化の追跡に時間を要している．条件を変更することを試みつつ，二重蛍光in situ hybridization法も検討している．
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| 今後の研究の推進方策 |
可視的にbipotential細胞を確認することが現時点では難しく，変更を加えているが，現在の条件でFACSを行いbipotential細胞集団の比率計測およびソーティングを行い，経時的なbipotential細胞数の変化を検討する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
胎生ラットの肺組織採取や，蛍光免疫染色の手技習得，実践に時間を要したことと，免疫染色によるbipotential細胞の可視化が困難であり，研究の遂行に時間を要したため．未使用額の使用用途については，今後の試薬購入や，高額なMicroarray解析，in-situ hybridizaton，magnetic-activated cell sortingなどの特殊解析に計上させていただきたい．
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