| 研究課題/領域番号 |
17K16731
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
西本 れい 岡山大学, 大学病院, 医員 (60789585)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ミクログリア / イオンチャネル |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、低体温療法の脳保護作用の分子基盤を明らかにするため、中枢神経系のグリア細胞であるミクログリアに発現する温度感受性分子を探索し、同定することである。これまでに申請者は、培養マウスミクログリアの動きに温度依存性があり、その動きは温度感受性TRPチャネルTRPM4の阻害剤9-phenthrolで抑制されることを見出していた。TRPM4活性化がミクログリアの動きの温度依存性に関与するか否かを検討するため、平成29年度にRNA干渉法によるTRPM4遺伝子ノックダウンを試みたところ、細胞状態の悪化のため解析に適さず、実験継続を断念した。平成30年度は、その代替法としてCRISPER/Cas9システムを用いたTRPM4遺伝子欠損マウスの作成に着手し、第１世代を得た段階である。平成31年度に、遺伝子欠損マウスを用いた実験を予定している。また、マウス蘇生後脳症モデルとして総頚動脈閉塞再灌流モデルを作成し、蘇生後脳症でのTRPM4の発現様式の検討のための免疫組織学的評価を予定している。これらと並行して、生理学研究所 富永真琴教授の協力のもと、２光子励起顕微鏡を用いてマウス大脳ミクログリアの動きを異なる温度条件で連続的に観察できるタイムラプスイメージングシステムを構築し、生きた個体レベルでのミクログリアの活動の温度変化による影響を検討した。その結果、ミクログリアの突起の動きは37度より33度の条件で可逆的に抑制され、温度依存性があることがわかった。以上の結果から、ミクログリアの動きの温度依存性は、細胞レベルだけではなく、生きた個体レベルで見られる現象であることを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画遂行が遅れている要因としては、RNA干渉法を用いた遺伝子ノックダウンを断念し遺伝子欠損マウスを作成する方針としたため、CRISPER/Cas9システムによるゲノム編集技術の習得及び環境整備に時間を要したこと、及びゲノム編集技術の習得のために平成30年度当初に予定していた免疫組織学的検討やタンパクレベルでの発現検討が着手できなかったことが挙げられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
２光子励起顕微鏡を用いた生きたマウス大脳ミクログリアの異なる温度条件下でのタイムラプスイメージングについて、TRPM4活性化の関与を検討するために、薬理学的検討（抑制剤の併用条件下での観察）を予定する。以上は生理学研究所 富永真琴教授の協力のもとすすめる。また、TRPM4遺伝子欠損マウスのラインを確立し、遺伝子欠損マウスを対象にした蘇生後脳症モデル作成、野生型と対比した組織学的評価、神経学的評価、行動学的評価実験を予定する。得られた研究結果に基づき、学会発表および論文投稿を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由として、平成30年度内に遺伝子欠損マウス作成が完遂できなかったため、動物購入費及び飼育費を一部使用しなかったことがあげられる。ほかに、また、免疫組織学的評価のための試薬などの物品購入を一部行わなかったこともあげられる。そのため、平成31年度に繰り越し費用が生じており、以後遺伝子欠損マウスのライン確立のための飼育、動物購入や試薬購入などに使用する予定である。
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