2017 年度実施状況報告書

CRISPR/Cas9を用いた卵巣癌の分子病理学的研究～ケモカインを標的として～

研究課題

研究課題/領域番号	17K16863
研究機関	和歌山県立医科大学
研究代表者	八幡環和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助教 (90647562)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード	卵巣癌 / ケモカイン / CRISPR/Cas9 system
研究実績の概要	本研究ではCRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いて，卵巣癌進展に関与する分子としてケモカイン受容体の遺伝子発現をノックアウトし，癌微小環境下における病態生理学的役割を解明し，卵巣癌における新規治療戦略を開発することを目的としている。まずreal time RT-PCRを用いてマウス卵巣癌細胞株であるID8およびHM-1のケモカイン受容体 (CCR1, CCR2, CCR5, CXCR4, CX3CR1)の発現を確認した。CRISPR/Cas9 systemの機能評価を行うため，予備実験として遺伝子組換え実験安全委員会の承認後，Programmed cell death ligand 1 (PD-L1)遺伝子のゲノム領域断片をpSpCas9(BB)-2A-GFP(pX458) vectorに組み込み，ベクターを構築し，ID8およびHM-1にリポフェクタミンを用いてトランスフェクト後，樹立した細胞株において蛋白レベルでのPD-L1が欠失していることを確認した。さらにDNAを抽出後，サンガーシークエンス法を用いて，標的領域において塩基配列の欠失や挿入が生じていることを確認し，卵巣癌細胞株においてCRISPR/Cas9ゲノム編集システムが目的遺伝子を欠損させることを実証した。次にケモカインレセプター遺伝子欠損細胞株を作製するため，CCR5, CXCR4, CX3CR1遺伝子のゲノム領域断片をpSpCas9(BB)-2A-GFP(pX458) vectorに組み込みベクターを構築した。今後，作製したベクターをID8およびHM-1にリポフェクタミンを用いてトランスフェクトし，樹立した細胞株においてreal time RT-PCR法，ウエスタンブロット法，フローサイトメトリー法を用いて各種遺伝子発現が欠損していることを確認する予定である．
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由遺伝子欠損卵巣癌細胞株を樹立するためのCRISPR/Cas9 systemについては，ほぼ確立された状態である点，そして今回標的としているケモカイン受容体についても2種類のマウス卵巣癌細胞株において発現を確認できた点，さらに同ケモカイン受容体遺伝子を欠損させるためのCRISPR/Cas9ベクターを作製できた点より，当初の実験計画通り概ね順調に進展していると考える。
今後の研究の推進方策	平成30年度においてはケモカイン受容体遺伝子を欠損させるためのCRISPR/Cas9ベクターを用いてマウス卵巣癌細胞株にトランスフェクト後，蛋白レベルおよび遺伝子レベルでケモカイン受容体遺伝子の発現と遺伝子変異を確認する。その上で，ケモカイン受容体遺伝子欠損細胞株を用いてin vitroおよびin vivoで卵巣癌進展の機能的役割について評価を行う予定である。
次年度使用額が生じた理由	（理由）今年度はCRISPR/Cas9 systemの構築のための予備実験を行った上で，本研究に着手したため，今年度の最終目標まで到達できず差額が生じた。（使用計画）来年度は本研究を進めていく予定であり，前年度の費用も合わせてin vitroおよびin vivo実験に必要な試薬やマウスの購入に充填する。