HPV維持複製における初期遺伝子群の発現解析：新規抗ウイルス薬への応用

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K16869
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 村上 功 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (70445237)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 低リスク型ヒトパピローマウイルス / 高リスク型ヒトパピローマウイルス / E1 / E6 / E7 / 生活環

研究実績の概要

初年度にnormal immortal keratinocytes (NIKS)にHPV11とHPV16を導入し、恒常的にHPVが発現しているNIKSの作製に成功した。さらに各々のHPV初期遺伝子と複製の関連を検討するためE1/E6/E7 deficient HPV11とHPV16をNIKSに導入し、7days assayを行った。
HPVを導入したNIKSをday1からday7まで培養し細胞を回収、AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kitを用いてDNA、RNA、タンパク質を抽出した。抽出したDNAから定量PCRにてゲノムコピー数を測定した。E6とE7 deficient HPVではHPV11、HPV16ともにday7でゲノムコピー数が維持されたのに対し、E1 deficientHPVではHPV11、HPV16ともにday7でゲノムコピー数の減少が認められた。HPV11、HPV16ともに宿主細胞の密度依存性にE1依存性の複製からE1非依存性の複製へ移行していることが分かった。
次にHPV11E6、HPV11E7、HPV16E6、HPV16E7を発現させたNIKSにHPV11を導入し、7days assayを行った。すると、全ての細胞株でHPV11ゲノムの維持が認められた。HPV11E6とE7は、HPV16E6、E7と同様の機能を有していることが分かった。
7days assayで回収した細胞からRNAを抽出しE6の発現を確認した。HPV16ではE6はday1からday7まで発現しているのに対し、HPV11ではE6の発現を認めなかった。これらの結果よりHPV11とHPV16においてE6とE7の機能に差を認めるのではなく、発現に差を認めることが明らかになった。
再現性を高めるためにHPV18（高リスク）を用い同様な実験を行い、HPV16と同様の結果を得た。

研究成果

• [雑誌論文] Roles for E1-independent replication and E6- mediated p53 degradation during low-risk and high-risk human papillomavirus genome maintenance (2019)
  • 著者名/発表者名: Isao Murakami, Nagayasu Egawa, Heather Griffin, Wen Yin, Christian Kranjec, Tomomi Nakahara, Tohru Kiyono, John Doorbar
  • 雑誌名: PLOS Pathogen 巻: May 13;15(5) ページ: －
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1007755
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] The HPV E4 is a candidate biomarker in cervical intraepithelial neoplasia grade 2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Murakami I, Iwata T, Egawa N, Saito M, Nakamura M, Morisada T, Tanaka K, Griffin H, Doorbar J, Aoki D
  • 学会等名: The 33rd International Papillomavirus Conference and Clinical Workshop
  • 国際学会