|
本研究の目的は、iPS細胞と気道上皮組織への分化誘導技術を利用することてin vitroで杯細胞過形成モデルの作製を試み、杯細胞過形成機構を解明することである。前年度において、マウスiPS細胞由来杯細胞過形成モデルを利用して杯細胞過形成に関与している遺伝子をマイクロアレイ解析によって抽出した。このため、最終年度ではヒトiPS細胞から杯細胞過形成モデルを作製するために、ヒトiPS細胞から気道上皮組織への分化誘導を行った。
1.ヒトiPS細胞から胚体内内胚葉への分化誘導 単層培養条件下でActivin (100ng/ml)とCHIR99021 (3μM)を添加し分化誘導した結果、未分化状態のヒトiPS細胞に比べ、分化細胞では胚体内内胚葉マーカーの発現量が上昇した。さらに、個々の細胞レベルでも胚体内内胚葉への分化を評価するために、免疫染色を行った結果、E-cadherin/Foxa2陽性の細胞を確認することができた。
2.ヒトiPS細胞由来胚体内内胚葉から前腸内胚葉への分化誘導 ヒトiPS細胞由来胚体内内胚葉に500ng/ml bFGF、SHH 50ng/mlを添加し分化誘導した結果、前腸内胚葉マーカーであるHNF1βとHNF4αの発現量が経時的に上昇した。また、免疫染色を行った結果、Sox2/Nkx2.1陽性の細胞を確認することができた。
3.FoxJ1コンディショナル強制発現ヒトiPS細胞株の作製 調節ベクターpEF1α-Tet3G vectorと、気道上皮細胞分化に関わる転写因子Foxj1を搭載した応答ベクターpTRE3G-mCherry vectorをエレクトロポレーションによってヒトiPS細胞に導入した。その結果、ドキシサイクリン未添加ではFoxj1の発現は誘導されなかったが、ドキサイクリンを添加した際にFoxj1の発現が誘導されるようなヒトiPS細胞株の作製に成功した。
|
