| 研究課題/領域番号 |
17K16981
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| 研究機関 | 東北医科薬科大学 |
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研究代表者 |
真鍋 法義 東北医科薬科大学, 薬学部, 講師 (10392383)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 白内障病態形成 / アミノ酸残基の非酵素反応 / 乳酸触媒 / リン酸触媒 / 計算化学と生化学実験 |
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| 研究実績の概要 |
白内障の病態形成に関わるクリスタリン中アスパラギン酸（Asp）残基の非酵素反応には、触媒が必要とされる。そこで、触媒として乳酸やリン酸、酸化残基が働いているという仮説のもと、計算化学・生化学実験を用いて研究を行っている。
計算化学のモデル化合物には、クリスタリン中のAsp残基を模倣するため、当研究室や関連研究で用いられているAce-Asp-Nme（ここでAceは-COCH3基、Nmeは-NHCH3基である。）やAce-トリプトファン (Trp)-Asp-Nmeを用いた。今年度は、昨年度の継続としてスクシンイミド（Suc）からL-β-Aspまでの反応についての計算を行った。その結果は、生体内で非酵素的に起こる反応の目安となる120 kJ/mol程度以下とはならなかったため、生化学実験の結果と比較し、引き続き水分子を配置するなどして計算を行っている。酸化残基を用いた計算では、未だ反応経路が見つかっていないため、検討を継続している。
生化学実験では、昨年度までに乳酸の濃度依存的にL-Aspの異性体であるL-β-Asp、D-Asp、D-β-Asp濃度が増加していくことを明らかとしたため、今年度は温度を変化させアレニウスプロットを利用して活性化障壁の計算を行った。その結果、昨年度に計算したL-Aspから中間体であるSucまでの活性化障壁101.6 kJ/molと比較して乳酸濃度100 mMでは97.1 kJ/molと、計算結果を生化学実験からも支持することができた。また、リン酸緩衝液の触媒効果は90 kJ/mol程度となり、様々な因子により反応が触媒されることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
解離状態の乳酸を触媒として配置したL-AspやL-アスパラギン (Asn)の非酵素反応は、L-Aspから中間体であるスクシンイミド（Suc）までの活性化障壁は101.6 kJ/molであった。また、Sucのラセミ化反応の活性化障壁は132.0 kJ/molであった。L-AsnからSucまでの反応は、活性化障壁が115.7 kJ/molであった。しかし、SucからL-β-Aspまでの反応の活性化障壁の値が生理的条件下での非酵素反応が進行する活性化障壁の目安である120 kJ/mol程度を下回っていないため、水分子を配置するなどして計算を継続している。酸化残基を用いた計算では未だ反応経路が見つかっていないため、検討を継続している。
生化学実験では、乳酸の濃度依存的にL-Aspの異性体であるL-β-Asp、D-Asp、D-β-Asp濃度が増加していくことを明らかとした。また、保存温度を変化させて異性化反応実験を行うことで、アレニウスプロットから活性化障壁の値を算出したところ、乳酸濃度100 mMでは97.1 kJ/molとなり、計算結果を生化学実験からも支持することができている。また、リン酸緩衝液の触媒効果は90 kJ/mol程度となり、緩衝液の影響も確認できた。様々な因子が触媒効果を発揮していることが明らかとなりつつある。紫外線の影響については、実験方法を詰めている段階である。
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| 今後の研究の推進方策 |
白内障の病態形成には乳酸やリン酸の関与が疑われる結果を計算化学的・生化学的に得ることができた。今後も、引き続き計算化学と生化学実験を併用することで、L-Aspの非酵素反応に関与している因子を探索していく。乳酸触媒に関しては、まだ十分に検討しきれていない反応段階があるため、水分子を配置するなどして活性化障壁の計算を行う。
紫外線の暴露によるL-Aspの非酵素反応の計算では、βA3-クリスタリンの97 残基目のAsp（Asp97）について、モデル化合物にAce-Trp-Asp-Nmeを用いて継続していたが、反応経路が見つかっていない。そこで、AspのC末側にTrpが存在しているγS-クリスタリンの162 残基目のAsp（Asp162）などについても検討に加えて計算を行う。これと並行して、紫外線の暴露による影響の生化学実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
第57回日本白内障学会・第44回水晶体研究会において発表を行ったが、若手研究者トラベルアワードを受賞することができ、科研費からの旅費の支出が行われなかったため。また、HPLC展開溶媒の購入が、保存場所の関係で今年度にずれたため。
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