ヒト軟骨前駆細胞由来膜状軟骨によるオーダーメイド軟骨再構築法の開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K17025
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 鍵本 慎太郎 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (10737480)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 軟骨再生医療 / 軟骨前駆細胞 / オーダーメイド軟骨再構築

研究実績の概要

肋軟骨や耳介軟骨を利用した自家軟骨組織移植は形成外科一般臨床で広く利用されている。例えば先天性疾患である小耳症における耳介形成手術や、事故などの後天性要因による顔面変形など、特に硬い組織の再建材料として有用である。シリコンなどの人工物と違って感染のリスクが少なく、また骨と違って吸収されにくく、かつ硬すぎないため加工しやすいといったメリットがる。ただし、組織採取による侵襲や長期の形態維持性に難があり、再生医療を用いた組織再構築方法が待望されている。
我々はヒト耳介軟骨に存在する軟骨前駆細胞を用いて軟骨再生医療の臨床応用を目指している。既に基礎研究からサルを用いた前臨床研究を行い一定の成果を得ているが、再構築組織の大きさや形態調整に課題がある。
本研究では、目的とする形態を、任意の大きさ・形態の再構築軟骨組織で作製することを目指し、膜状軟骨によるオーダーメイド軟骨再構築法に着目した。まず①目的とする形態を３Dプリンターを用いて実体モデル化し、型を作成する。次に②ヒト耳介軟骨前駆細胞を用いてIn vitroで膜状の軟骨を作成する。最後に③作製した膜状の軟骨を①で作製した型とあわせてin vivoで培養し得られた再構築組織の形態や組織学的評価、生化学的評価を行う。
研究成果として、①の実態モデルは小耳症患者のCTデータからSTLデータに変換し、購入した３Dプリンターを用いて作製した。CTデータの閾値を調整することで、より目的に即した軟骨形態を作製することに成功した。②の膜状軟骨の作製においては、参考にしていたLiaoの論文を用いて作製するも適度な膜状軟骨の作製に至らず、現時点で③まで進めていない。まずは②の条件検討を追加し、③へ進めるため、研究期限を１年延長し追加実験予定である。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

前述のとおり、①の実態モデル作製は成功した。②の軟骨前駆細胞を用いた基礎実験において苦慮しており、その先に進めていない。
Liaoの論文の通りの基礎培地を用いて軟骨前駆細胞を培養、分化誘導し膜状軟骨作製を試みたが、膜としての形態を維持できずばらばらに崩れてしまう。また、攝子などでつまむことは不可能であった。
本来なら③において実体モデルに作製した膜状軟骨を巻き付けるが、②で作製した軟骨膜がもろく弱いため、当初の計画を変更し、くずれた破片を重ねて実体モデル上に保持し、そのままIn vitroで2週間培養した。その後in vivoへの移植を計画したが、作製した膜状軟骨は形態維持どころか、組織の再構築が得られておらず断念した。回収した組織の染色を試みたが、軟骨組織の再構築が得られていなかった。
以上より、②の膜状軟骨組織作製が原因と考え追加実験予定である。期間を１年延長申請した。

今後の研究の推進方策

上述のとおり②の膜状軟骨組織作製に問題があると考えている。論文のとおりの培地で再度行うことに加え、当科で軟骨拡大培養に用いた培地や、軟骨分化誘導に用いた培地などを用いて条件検討を行い、参考論文を超えて膜状軟骨の作製を試みる。上記検討で膜状軟骨の作製が得られれば③へ進み、in vitroでの3次元形状の評価を行う。

次年度使用額が生じた理由

前述のとおり基礎実験の追加が必要である。条件検討に用いる培地やピペット、ディッシュなどの消耗品、また成果報告や論文報告の場合の経費として計画している。